[发明专利]沉积物中DNA的预处理方法

说明书

本发明公开了一种沉积物中DNA的预处理方法，具体步骤如下：取5～10kg沉积物，加入4～6倍重量的水，搅拌混匀，沉降15～20min；(2)取上清5～10L，加入100～200g明矾，100～200g焦磷酸钠，搅拌混匀，沉降10～15min；(3)取上清3～6L，加入50～100g Tris，40～80g聚乙烯吡咯烷酮，23～47g NaCl，2～4g Triton X‑100，搅拌混匀，沉降15～20min；(4)取上清1.5～3L，提取DNA。本发明提供的一种大量沉积物中DNA的预处理方法，不仅能获得高纯度DNA，还能够准确反映物种的多样性。

技术领域

本发明涉及一种沉积物中DNA的预处理方法，属于环境科学与生物工程技术领域。

背景技术

环境样品是一种十分复杂的体系，一般由多种生物组成且化学成分复杂，如河流底泥是由细菌等微生物和原生动物、后生动物等微型动物组成的生态系统与胶体物质结合所形成的絮状体颗粒。因此，环境样品具有菌群结构多样、菌群功能复杂、可能含有腐殖酸、有机物、重金属等DNA杂交和PCR扩增抑制剂等特点。

以往提取河流底泥DNA，都是称取少量底泥用于提取DNA，而且底泥中的悬浮物、胶体物质、硫化物、腐殖质等对溶菌酶、蛋白酶K和Taq酶的活性有抑制作用，导致提取的DNA涵盖的物种少，纯度不够，不能准确地反映底泥中物种的多样性。

因此，提供一种大量沉积物中DNA的预处理方法，获得能够准确反映物种多样性且纯度高的DNA，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种大量沉积物中DNA的预处理方法，用来解决提取的DNA涵盖的物种少，纯度不够，不能准确地反映河流环境样品中物种多样性的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种沉积物中DNA的预处理方法，具体步骤如下：

(1)取5～10kg沉积物，加入4～6倍重量的水，搅拌混匀，沉降15～20min；

(2)取上清5～10L，加入100～200g明矾，100～200g焦磷酸钠，搅拌混匀，沉降10～15min；

(3)取上清3～6L，加入50～100g Tris，40～80g聚乙烯吡咯烷酮，23～47g NaCl，2～4g TritonX-100，搅拌混匀，沉降15～20min；

(4)取上清1.5～3L，经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于无菌离心管中，加入无菌水，涡旋震荡，离心，取上清液，提取DNA。

优选地，步骤(1)所述沉积物为河流底泥。

优选地，步骤(3)中还加入50～100g脱脂奶粉。

优选地，步骤(4)取上清1.5～3L，经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于10mL无菌离心管中，加入2～4mL无菌水，涡旋震荡5～10min，8000～12000rpm离心5～10min，取上清液，提取DNA。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种沉积物中DNA的预处理方法，先通过悬浮沉降去除大部分泥沙，然后利用明矾沉降细菌、藻类、泥沙、粘土等悬浮物，焦磷酸钠不仅能与金属离子生成络合物，还能作为分散剂将微生物与沉积物分离开；聚乙烯吡咯烷酮能与腐殖酸形成稳定的复合物，且聚乙烯吡咯烷酮的聚合度高，不溶性复合物即沉降到容器底部。本发明提供的一种沉积物中DNA的预处理方法，对大量沉积物进行预处理，去除悬浮物、腐殖质等影响DNA提取的物质，确保提取的DNA不仅纯度高，而且能够准确反映物种的多样性，避免因沉积物采样过少导致的物种多样性降低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。