[发明专利]一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法

权利要求书

1.一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、表达载体构建：选取耐热性抗菌肽与IHF-α设计融合蛋白，合成后卡入到pET-22b质粒表达载体中，融合蛋白的合成与表达采用常规方法；

二、转化克隆、蛋白表达纯化步骤：

1)转化

对融合蛋白质粒表达载体进行热激法转化：

将BL21感受态细胞置于冰上，加入重组质粒，冰上静置30min，置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min，加入LB液体培养基，225rpm，37℃培养1h，取菌液涂布于LB固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养；

2)蛋白诱导

2) .1在LB液体培养基中加千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时；

2) .2扩培，在LB液体培养基中加入千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，再加入百分之一体积数的过夜培养的菌液，置于37℃、225rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定OD₆₀₀值为0.6-0.8后，加入诱导剂IPTG诱导，诱导条件为低温16℃、225rpm诱导13小时；

3)提取蛋白

3) .1将诱导过的菌液，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体；

3) .2离心菌体加入Buffer A缓冲溶液充分吹打混匀；

3) .3离心13000rpm，10min，4℃，保留沉淀；

3) .4在沉淀中加入Buffer A缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解在溶液中；

3) .5利用超声破碎机在超声强度为20％的条件下，每次间隔5s持续超声破碎5s，直至溶液呈半透明状态；

3) .6离心13000rpm，4℃，30min后，弃去沉淀保留上清溶液；

4)蛋白纯化

4) .1将上一步获得的上清溶液，加入30％-80％的饱和硫酸铵溶液，充分混匀，随后置于4℃冰箱静置2-6h；

4) .4将溶液在85℃金属浴中加热，20min；

4) .5离心13000rpm，4℃，30min，除去不可溶解以及不耐热的蛋白杂质，弃去沉淀，保留上清溶液；

所述的Buffer A缓冲溶液由20mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.5mM DTT和1mM PMSF组成；

所述IHF-α的核苷酸序列为：

atggcgc ttacaaaagc tgaaatgtca gaatatctgt ttgataagct tgggcttagc

aagagggatg ccaaagaact ggttgaactg tttttcgaag agatccgtcg cgctctggaa

aacggcgaac aggtgaaact ctctggtttt ggtaacttcg atctgcgtga taagaatcaa

cgcccgggac gtaacccgaa aacgggcgag gatattccca ttacagcaag gcgcgtggtg

accttcagac ccgggcagaa gttaaaaagc agggtcgaaa acgcttcgcc caaagacgag。

2.如权利要求1所述的一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，其特征在于，所述耐热性抗菌肽为牛乳铁蛋白肽LfcinB、乳酸链球菌素Nisin、LL-37的衍生肽SAAP-148中的任一种。

3.如权利要求1所述的一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，其特征在于，所述饱和硫酸铵溶液体积百分数为50％。