[发明专利]一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法

说明书

本发明公开一种利用蛋白IHF‑α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，通过IHF‑α蛋白与耐热性抗菌肽进行融合基因设计，设计成为含有IHF‑α蛋白与耐热性抗菌肽基因序列的质粒，在大肠杆菌中进行转化和克隆表达得到蛋白后，并对蛋白纯化，最终得到含有耐热性抗菌肽的融合蛋白。本发明方法将难表达的耐热性抗菌肽利用耐热性的IHF‑α融合表达，使抗菌肽潜在的抑菌性能够得到抑制，使得抗菌肽可以可溶性表达。该方法操作简单，将难表达、小分子量的抗菌肽，通过与耐热性的IHF‑α联合表达，使得耐热性抗菌肽快速简便获得。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法。

背景技术

抗菌肽属于内源性肽类，是构成先天免疫系统的重要组成部分，通常含有少于50个氨基酸，其中约50％属于疏水性氨基酸，并且抗菌肽绝大多数具有耐热性。抗菌肽具有两个显著的特性，第一，具有广泛的抗菌活性；其次，它们主要针对微生物膜阻碍微生物的生长发育。目前耐药性细菌对动物和人类健康造成了严重威胁，这些多肽因其具有较强的抗菌活性和独特的杀菌机理而受到越来越多的关注，被认为有望成为新型饲料和医药抗生素替代品，因此需要制备大量的高纯度抗菌肽来满足基础研究和临床试验的需要。

当前抗菌肽的获得主要有化学合成、直接在自然中分离获取、重组蛋白的三种方法。而化学合成、直接获取抗菌肽的成本太高，也不便于大规模的生成。重组蛋白方法虽易于量产，但这些重组方法多利用昂贵的分离柱纯化，成本较高，在工业规模上目前还不具备生产抗菌肽的能力与条件。

另外，现在的融合标签多选择硫氧还蛋白、GST等来构成重组蛋白，而这些标签因蛋白过大，促可溶性表达效果差，给重组蛋白的纯化带来了极大的障碍。

宿主整合因子(Integration Host Factor，IHF)是一种由α和β亚基组成的杂二聚体蛋白，具有热稳定的性质，IHF-α亚基由himA编码(11.35kD)和，IHF-β亚基由hip编码(10.65kD)。

IHF-α是一种耐热的、不结合核酸的蛋白，IHF-β是一种核酸结合的蛋白。将IHF-α与抗菌肽进行融合设计，可以将抗菌肽对宿主菌的致死性隐藏，同时抗菌肽的体积小、阳离子性高，使其极易发生蛋白质降解，融合表达构建了一种有效克服耐热性抗菌肽表达障碍的一种方案。选择IHF-α亚基也避免了IHF中的IHF-β亚基与核酸结合，在表达后的纯化过程也避免了因引入了核酸而添加去除核酸的PEI和PEG高分子化合物，而PEI和PEG有毒。将IHF-α与抗菌肽进行融合设计表达抗菌肽，为今后抗菌肽作为绿色添加剂应用于食品、农业、畜牧业和临床医学提供一种可行方案。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明通过巧妙设计和大量的反复试验，提供一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，该方法可以极大地减少成本，为蛋白重组的大规模工业化提供了一种可能性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，包括如下步骤：

一、表达载体构建：选取耐热性抗菌肽与IHF-α设计融合蛋白，合成后卡入到pET-22b质粒表达载体中，融合蛋白的合成与表达采用常规方法；

二、转化克隆、蛋白表达纯化步骤：

1)转化

对融合蛋白质粒表达载体进行热激法转化：

将BL21感受态细胞置于冰上，加入重组质粒，冰上静置30min，置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min，加入LB液体培养基，225rpm，37℃培养1h，取菌液涂布于LB固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养；

2)蛋白诱导