[发明专利]一种用于嗜热微生物遗传操作的诱导型毒素-抗毒素元件

说明书

本发明公开了一种用于嗜热微生物遗传操作的诱导型毒素‑抗毒素元件；所述元件携带有诱导型启动子、热稳定的毒素基因和抗毒素基因；所述制备方法包括构建正向选择标记和诱导型毒素‑抗毒素反向选择标记；该原件可在嗜热微生物中进行遗传操作。本发明提供的热稳定的毒素抗毒素元件可在嗜热微生物中进行遗传操作时作为高效的选择性标记，该元件可应用于嗜热微生物的分子遗传学研究。

技术领域

本发明涉及一种利用热稳定的毒素-抗毒素元件构建遗传筛选标记的方法和应用，具体涉及通过高静水压力诱导此类毒素-抗毒素元件在超嗜热微生物中进行遗传操作的方法和应用。

背景技术

超嗜热微生物遗传操作研究已经有超过20年的时间，但是由于高温条件的限制，已开发可用的遗传工具数量非常有限。例如，热球菌Thermococcus kodakaraensis KOD1是第一个发展了基因敲除系统的菌株，其使用pryF基因作为筛选标记，尿嘧啶缺陷菌株作为出发菌株配合合成培养基使用。随后几种氨基酸缺陷标记陆续被开发：像色氨酸缺陷菌株,组氨酸缺陷菌株，但这些标记只能在合成培养基中使用。直到开发了辛伐他丁/HMG-CoA还原酶过表达系统，其真正实现了在富营养培养基中操作。但是目前为止，超嗜热古菌中还没有科学家开发出一套可以直接在原养型菌株中进行无痕敲除的遗传系统。目前超嗜热菌遗传操作的出发菌株皆为氨基酸/核苷缺陷菌株，相比于原养型菌株，缺陷菌株对于代谢网络和适应性研究具有一定的干扰，增加了研究难度。而且在合成培养基中进行遗传操作由于菌株生长较慢需要花费更长的时间。因此亟需开发一种可在原养型菌株中进行遗传操作的遗传系统。

最近，毒素抗毒素(TA)系统已经在中温细菌中实现了遗传操作。特别是II型的TA系统，由于毒素与抗毒素都是蛋白，并且直接相互作用，毒素蛋白通过转录或翻译抑制菌体生长，抗毒素可以中和这种毒性，而且TA系统广泛分布在细菌和古菌中，特别是能耐受更高温度的超嗜微生物中寻找可用的TA系统用于遗传操作是一种可行的方案。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可直接应用于原养型超嗜热微生物的遗传操作的选择性元件，具体是一种用于超嗜热微生物遗传操作的高静水压诱导的毒素-抗毒素元件；本发明还提供了制备上述选择性元件的方法和其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种热稳定的毒素-抗毒素选择性筛选标记HHP-TAC，所述选择性筛选标记HHP-TAC包含来自于超嗜热古菌的高静水压力诱导型启动子、热稳定性毒素基因和抗毒素基因、组成型启动子以及HMG-CoA还原酶基因。

优选地，所述组成型启动子包括组成型启动子P_hmtB和组成型启动子P_gdh。

进一步优选地，所述组成型启动子P_hmtB和P_gdh区域来源于质粒pTS535。

优选地，所述诱导型启动子是来自于超嗜热古菌Pyrococcus yayanosii的高静水压力诱导型启动子P_hhp；热稳定性毒素和抗毒素的编码基因分别来自于超嗜热古菌P.furiosus的PF0776基因和PF0775基因。

优选地，所述选择性筛选标记HHP-TAC的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明涉及一种选择性筛选标记HHP-TAC的制备方法，包括如下步骤：

使用融合PCR扩增技术，依次将高静水压力诱导型启动子与热稳定性毒素基因融合，组成型启动子与抗毒素基因融合，以及组成型启动子与HMG-CoA还原酶基因融合，获得所述选择性筛选标记HHP-TAC。