[发明专利]一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法

说明书

本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，解决了通过硅藻培养提取的方法制备软骨藻酸培养周期长、成本高的问题，公开了一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法。该制备方法为先进行菌株活化，然后接种到种子培养液中进行培养，再接种到发酵液中进行发酵得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液，最后对菌株进行浸泡提取，纯化得到遗忘性贝毒软骨藻酸。本发明通过细菌发酵的方法制备软骨藻酸具有发酵时间短，成本低，代谢调控相对简单。

技术领域

本发明涉及海洋微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法。

背景技术

软骨藻酸(Domoic acid,DA)属于记忆缺失性贝类毒素(Amnesic shellfishposoning，ASP)的主要毒素成分，是一种相对罕见的神经毒性氨基酸。近三十年来，海洋环境污染日趋加重，赤潮频繁发生，软骨藻酸作为一种兴奋性脯氨酸衍生物和神经毒素，主要由形成赤潮的一种硅藻多列拟菱形藻产生，其最早是在1987年加拿大因食用紫贻贝而造成的食物中毒事件中被发现，软骨酸藻可影响人和动物的消化道、心血管系统、中枢神经系统、它对与内脏功能有关的脑干区域具有兴奋作用，对与记忆有关的脑区域具有明显的神经毒性作用，中毒者主要表现为腹痛、腹泻、呕吐，同时伴有严重的记忆缺失、意识混乱、平衡失调等症状，严重者处于昏迷状态。永久性丧失部分记忆乃至死亡是此类中毒的典型特征。DA在有害赤潮检测、神经生物学、医学诊断、生化战剂等研究中均有重要应用。目前，软骨藻酸的获得主要通过产毒硅藻的规模培养及产物提取制备而来。该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。

发明内容

本发明是为了克服现有技术通过硅藻培养提取的方法制备软骨藻酸培养周期长、成本高的问题，提供一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，通过细菌发酵的方法制备软骨藻酸具有发酵时间短，成本低，代谢调控相对简单。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，包括以下步骤：

1)菌株活化：将斜面菌种接种到摇瓶种子液培养基中，在30-32℃下培养12-15h，得到活化菌株种子液；

2)种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，121-123℃灭菌25-35min，冷却至30-31℃，采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，通气搅拌，通气量为40-50L/min，搅拌速率为160-180r/min，30-33℃下恒温培养15-18h，得到种子液；

3)发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，121-123℃灭菌25-35min，冷却至30-31℃，将步骤2)得到的种子液接种到发酵液中，通气搅拌，通气量为40-60L/min，搅拌转速140-160r/min，30-33℃下恒温培养48-52h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；

4)提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置10-20min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10-20min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10-20min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物；

5)纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。

作为优选，所述步骤1)中菌种为海洋硅藻共栖细菌Ponticoccus sp.LZ-7。

作为优选，所述步骤1)中摇瓶种子液培养基包括以下质量百分数的组分：

酵母膏3-6％，蛋白胨2-5％，葡萄糖0.5-1％，余量为天然海水。

作为优选，所述步骤2)中活化菌株种子液接种量为10～15％。