[发明专利]一种钴胺素生产菌种高效选育方法

权利要求书

1.一种钴胺素生产菌种高效选育方法，其特征在于：包括以下步骤：

培养斜面菌种：在无菌室内采用接种环蘸取冻存菌液的方法将钴胺素菌涂布于无菌斜面，然后将斜面置于生化培养箱，恒温培养，温度30±2℃；培养时间48-56h，完成斜面种制备；

诱变菌液制备：用生理盐水将步骤（1）中培养完成且生长成熟的斜面菌洗下，每个斜面用生理盐水1ml，将洗下的斜面菌加入盛有20ml生理盐水的100ml玻璃烧杯中，在无菌环境下，用磁力搅拌器搅拌2-5min，制得诱变菌液；

紫外诱变：将步骤（2）制得的诱变菌液置于超净台上，诱变菌液液面距离紫外灯23.5-25cm，开启紫外灯，照射16-20s，关闭紫外灯，用黑色塑料袋罩烧杯30-40min，完成紫外诱变；

抗性涂布：将步骤（3）中经过诱变的菌液进行梯度稀释，由10^-1分别稀释至10^-8，然后分别吸取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的诱变的菌液涂布抗性平板，抗生素选用小诺霉素，平板抗生素浓度25-35mg/L；

平板培养及挑单菌：将步骤（4）制得的平板置于培养箱中培养32-40h，然后挑取直径最大的菌落，涂斜面，置于培养箱中培养48-55h，即得。

2.如权利要求1所述的一种钴胺素生产菌种高效选育方法，其特征在于：所述步骤（1）中钴胺素菌采用脱氮假单胞菌。

3.如权利要求1所述的一种钴胺素生产菌种高效选育方法，其特征在于：所述步骤（1）中斜面培养时间为50h。

4.如权利要求1所述的一种钴胺素生产菌种高效选育方法，其特征在于：所述步骤（3）中诱变菌液液面距离紫外灯24cm。

5.如权利要求1所述的一种钴胺素生产菌种高效选育方法，其特征在于：所述步骤（3）中诱变时紫外灯照射时间为18秒。

6.如权利要求1所述的一种钴胺素生产菌种高效选育方法，其特征在于：所述步骤（4）中抗性涂布平板选用的小诺霉素浓度为28mg/L。

7.如权利要求1所述的一种钴胺素生产菌种高效选育方法，其特征在于：所述步骤（5）中将平板置于培养箱中培养36h，然后挑取直径最大的菌落，涂斜面，置于培养箱中培养51h。