[发明专利]一种钴胺素生产菌种高效选育方法

说明书

本发明涉及菌种诱变技术领域，尤其是一种钴胺素生产菌种高效选育方法。该种种钴胺素生产菌种高效选育方法通过筛选合适的紫外线作用强度，使假单胞菌产生一定致死致畸的变异率，从而产生正向突变，继而通过特异抗生素的抗性筛选，定向维持紫外线诱变的正向突变，提高了菌种筛选效率和选育优良菌种的准确性，从而稳定得到生产性能较高的菌株，使发酵的工业化生产稳定高效，有效减少了因菌种退化造成的成本上升。

技术领域

本发明涉及菌种诱变技术领域，尤其是一种钴胺素生产菌种高效选育方法。

背景技术

钴胺素，又名维生素B12 是一类含咕啉环化合物三价钴位于类似卟啉的咕啉环平面的中心，与钴离子连接的基团多为脱氧腺苷(5'- deoxyadenosyl)甲基(-CH3)氰基(-CN)，从而形成腺苷钴胺素甲基钴胺素和氰钴胺素，由于维生素B12的化学结构式极其复杂，化学合成需要70多步反应且成本十分昂贵，且生产过程会产生很大环保压力，因此现行工业发酵过程中主要利用深层液体发酵技术直接生产。

目前发酵生产钴胺素一般利用脱氮假单胞菌进行，此菌属革兰氏阴性菌，是无核细胞，以极生鞭毛运动，不形成芽孢，化能有机营养，严格好氧；对发酵条件要求苛刻，培养基复杂，因此选育生产性能优良生长健壮稳定的菌株是钴胺素发酵生产一直要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种钴胺素生产菌种高效选育方法，克服上述现有技术存在的不足，提高菌种筛选效率和选育优良菌种的准确性，稳定得到生产性能较高的菌株。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种钴胺素生产菌种高效选育方法，包括以下步骤：

（1）培养斜面菌种：在无菌室内采用接种环蘸取冻存菌液的方法将钴胺素菌涂布于无菌斜面，然后将斜面置于生化培养箱，恒温培养，温度30±2℃；培养时间48-56h，完成斜面种制备；

（2）诱变菌液制备：用生理盐水将步骤（1）中培养完成且生长成熟的斜面菌洗下，每个斜面用生理盐水1ml，将洗下的斜面菌加入盛有20ml生理盐水的100ml玻璃烧杯中，在无菌环境下，用磁力搅拌器搅拌2-5min，制得诱变菌液；

（3）紫外诱变：将步骤（2）制得的诱变菌液置于超净台上，诱变菌液液面距离紫外灯23.5-25cm，开启紫外灯，照射16-20s，关闭紫外灯，用黑色塑料袋罩烧杯30-40min，完成紫外诱变；

（4）抗性涂布：将步骤（3）中经过诱变的菌液进行梯度稀释，由10^-1分别稀释至10^-8，然后分别吸取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的诱变的菌液涂布抗性平板，抗生素选用小诺霉素，平板抗生素浓度25-35mg/L；

（5）平板培养及挑单菌：将平板置于培养箱中培养32-40h，然后挑取直径最大的菌落，涂斜面，置于培养箱中培养48-55h，即得。

优选的，所述步骤（1）中钴胺素菌采用脱氮假单胞菌。

优选的，所述步骤（1）中斜面培养时间为50h。

优选的，所述步骤（3）中诱变菌液液面距离紫外灯24cm。

优选的，所述步骤（3）中诱变时紫外灯照射时间为18秒。

优选的，所述步骤（4）中抗性涂布平板选用的小诺霉素浓度为28mg/L。

优选的，所述步骤（5）中将平板置于培养箱中培养36h，然后挑取直径最大的菌落，涂斜面，置于培养箱中培养51h。