[发明专利]一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，包括启动子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和终止子。

2.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述启动子是山羊β酪蛋白基因启动子。

3.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人凝血因子IX为高凝血活性突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，位置1960-1961位的核苷酸为GC而非CG。

4.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述的凝血因子IX为高活性突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，位置384的氨基酸为A而非R。

5.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人免疫球蛋白IgG1的Fc段核酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.根据权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述人凝血因子IX基因与人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因之间包括接头序列。

7.根据权利要求6所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，所述接头是由氨基酸序列(GGGGS)n表示的肽，其中n是1-20的整数，所述的接头还包含一段柔性多肽EFAGAAAV的肽。

8.一种利用转基因动物乳腺生物反应器生产高活性重组人凝血因子IX融合蛋白的方法，其特征在于，将含有权利要求1所述高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因的载体经原核显微注射整合入受精卵使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌所述的外源重组凝血因子IX融合蛋白；所述哺乳动物为小鼠，牛或羊。

9.一种高活性凝血因子IX的突变蛋白的乳腺特异表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将凝血因子IX(R384A)突变的人凝血因子IX基因与人IgG1的Fc片段cDNA通过接头序列连接构建入载体中，得到重组质粒；

(2)将上述重组载体显微注射导入小鼠受精卵，制备hFIX-Fc转基因小鼠；

(3)PCR法鉴定阳性小鼠，取阳性小鼠交配繁育，获得阳性母鼠乳汁；

(4)检测小鼠乳汁中的hFIX-Fc融合蛋白表达情况。

10.根据权利要求9所述高活性凝血因子IX的突变蛋白的乳腺特异表达载体的制备方法，其特征在于，所述重组载体为真核表达载体pcDNA3.1(-)。