[发明专利]一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法。包括启动子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和终止子。本发明利用载体将人FIX‑Fc融合蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，从转基因动物乳汁中获得人FIX‑Fc融合表达蛋白。依据本发明的方法，在动物乳汁中表达的人FIX活性可达6IU/ml，平均比活可高达3000IU/mg，比天然FIX高约12倍，可用于人凝血因子IX的生产。

技术领域

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法。

背景技术

血友病B是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，男性新生儿中的发病率约为1/25000，因患者凝血因子IX(FIX，Factor IX)基因突变导致体内FIX蛋白合成缺乏所致，患者易发生自发性出血，重症患者常因关节出血、脑出血等导致残疾，影响生活质量和寿命。目前，血友病B患者主要依靠静脉输注补充外源凝血因子IX来进行治疗，这类产品包括血液来源和重组来源的凝血因子IX制品。

人免疫球蛋白IgG的Fc片段可通过与FcRn结合介导与其融合蛋白的再循环过程，从而延长目标蛋白的半衰期，该方法在药物的生产中已经得到了广泛应用。百健公司的Alprolix是首个上市的FIX-Fc融合蛋白药物，临床研究显示其与野生型的FIX相比具有等同的活性，但半衰期显著增加2-3倍，有效缩短了患者的用药间隔(NCT01425723)。

凝血因子IX存在一系列功能获得性(gain-of-function mutation)突变可使凝血活性获得不同程度的增加。例如，2009年在一个意大利家族中发现的突变型FIX蛋白，其384位由精氨酸变为亮氨酸(R384L，也被称为FIX Padua)，该突变导致FIX凝血活性增加5-10倍。目前该突变型已被用于基因治疗研究，临床试验取得了良好的效果(PCT/EP2009/061935)。另有一篇1999年发表于the Journal of Biological Chemistry的文章中描述了FIX的另一个功能获得性突变(R384A)，体外研究显示该突变相比野生型活性增加2-3倍[Jinli Chang,Jianping Jin,Pete Lollar,et.al.Changing Residue 338in HumanFactor IX from Arginine to Alanine Causes an Increase in Catalytic Activity[J].The Journal of Biological Chemistry,1998,273(20):12089–12094]；转基因动物乳腺表达的该突变体蛋白的体内外凝血活性可提高2.5-3倍[YAN J-B,WANG S,HUANG W-Y,et al.Transgenic Mice Can Express Mutant Human Coagulation Factor IX withHigher Level of Clotting Activity[J].Biochemical Genetics,2006,44(7-8):347-358.]。功能获得性突变体在血友病B基因治疗和重组蛋白药物研发的应用可提高凝血因子IX的活性表达水平，具有重要的应用价值。

目前，重组人凝血因子通常产量较低、半衰期短、价格昂贵。而与重组细胞生产凝血因子IX相比，动物生物反应器的生产成本相对低廉，是廉价大量生产FIX的一个潜力方向。发明人利用的牛乳腺生物反应器及ProGenes公司的猪乳腺生物反应器均可人FIX的表达，临床前体内和体外活性试验证实所产生的FIX具有高效凝血活性。但在已公开的任何报道中还未有报道利用乳腺生物反应器表达FIX融合蛋白的先例，也未知乳腺生物反应器表达FIX融合蛋白是否仍具有FIX活性并能维持高表达水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法。

一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白基因，其特征在于，包括启动子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和终止子。