[发明专利]一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法

权利要求书

1.一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞的复苏与传代培养；

步骤2：对步骤1所得鸭胚细胞衍生的传代细胞进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种培养；

步骤3：接毒后，每隔12-18h取样测定病毒的TCID₅₀，在病毒TCID₅₀达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸡传染性法氏囊病病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2的鸡传染性法氏囊病病毒接种方法为二阶培养法，所述步骤2的操作方式如下：待全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，接毒完成后，将摇瓶放置于5％CO₂培养箱中，在低转速下吸附0.5h-2h；吸附完成后补加病毒培养基，并放回到5％CO₂培养箱中，调节合适转速，继续培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤4：取步骤3所得培养后的传染性法氏囊病病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用二阶培养法，将病毒接种至全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获传染性法氏囊病病毒为鸭胚细胞衍生的传代细胞系的适应毒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞复苏与传代培养方法如下：

从液氮中取出鸭胚细胞衍生的传代细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待细胞完全融化后，将复苏细胞加入约20倍体积的细胞培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，使用细胞培养基将细胞吹打重悬均匀，细胞悬液接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养；每隔24h少量取样一次进行细胞计数，通过检查细胞密度和细胞活力等参数，监测细胞生长情况；培养约48-72h，达到一定细胞密度后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养温度为35℃-37℃；培养转速为130rpm-150rpm。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鸭胚细胞衍生的传代细胞密度达到6×10⁶/mL-15×10⁶/mL时，可用于传染性法氏囊病病毒的接种。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述传染性法氏囊病病毒接毒量为0.001MOI-1MOI之间接种。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的二阶培养法接毒，细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养温度为35℃-37℃；培养转速为110rpm-140rpm。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒接种吸附完成后，需补加新的培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中使用的培养基中含有10-100mg/L氨基酸、1-10mg/L维生素、100-500mg/L无机盐、1000-8000mg/L葡萄糖、0.01-1mg/L微量元素、0.1-10mg/L生长因子，其中氨基酸选自丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、色氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种，所述维生素选自维生素C、生物素、叶酸、氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、吡哆醛、维生素B12、核黄素、盐酸硫胺素中的一种或多种，所述无机盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的一种或多种，所述微量元素选自硫酸锰、亚硒酸钠、硝酸铁中的一种或多种，所述生长因子选自胰岛素、EGF、bFGF中的一种或多种。