[发明专利]一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法

权利要求书

1.一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：

1)胎肝干细胞的分离培养和扩增；

2)胎肝干细胞的鉴定；

(2)胎肝干细胞的诱导分化：

a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养6-8天；

b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养6-8天；

c)将步骤b)所获得的细胞用加入含有HGF因子的细胞快速扩增培养基，继续快速扩增6-8天，以获得有功能的肝细胞。

2.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中进行胎肝干细胞的诱导分化过程所采用的具体步骤如下：

a、利用含肝脏组织上清液的培养基启动胎肝干细胞向肝细胞分化；

b、利用含有Notch信号通路抑制剂为γ-分泌酶抑制剂的培养基加速胎肝干细胞向肝细胞分化；

c、利用含有肝脏成熟因子HGF的培养基完成胎肝干细胞向肝细胞分化。

3.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤b)中的Notch信号通路抑制剂为γ-分泌酶抑制剂，且γ-分泌酶抑制剂的浓度为0.5μmol/L-1.5μmol/L。

4.根据权利要求3所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述γ-分泌酶抑制为DAPT、LY-450139、MK-0752、E2012、BMS-708163、PF-3084014以及2GSI-953中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述加入HGF的Williams’E培养基的稀释终浓度为15ng/mL-25ng/mL。

6.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，还包括培养成熟肝细胞，其具体步骤如下：

A、对步骤(c)所培养的细胞每隔1-3天进行换液处理，待细胞长满细胞培养瓶后进行细胞传代处理；

B、对步骤A所获得的细胞培养25-35天，即为成熟肝细胞。

7.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤2)中胎肝干细胞的鉴定方法：通过免疫组化和免疫荧光多重抗体染色对干细胞进行鉴定。

8.根据权利要求7所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述免疫组化和免疫荧光多重抗体染色所采用的干细胞标记物为CD133、EpCAM、CD49f、Dlk1或CD13。