[发明专利]一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法

说明书

本发明公开了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，属于生物技术领域，包括以下步骤：(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：a)胎肝干细胞的分离和扩增；b)胎肝干细胞的鉴定；(2)胎肝干细胞的诱导分化：a)在干冰上低温收集正常肝脏组织研磨匀浆后制成的组织悬液，离心后收集上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养以获得肝祖细胞；b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养以获得肝样细胞；c)将步骤b)所获得的细胞用加入含HGF的细胞快速扩增培养基培养，以获得有功能的肝细胞，能快速、准确、高效地将我们前期获得的胎肝干细胞诱导分化为具有功能的肝细胞。

技术领域

本发明属于生物技术的技术领域，具体涉及一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法。

背景技术

原位肝移植是治疗终末期肝病的金标准。但是，肝源的短缺成为了肝细胞移植在临床应用上最大的瓶颈，限制的其有效开展。所以，找到合适的、丰富的肝细胞来源是现在生物学领域研究的热点。同时，大量研究证实，细胞疗法是治疗终末期肝病(End-stageliver diseases,ESLDs)有效的方法之一，应用前景十分光明。胎肝干/祖细胞(FLSPCs)具有成活率高，增殖量小，安全性高等优点，是用于肝脏疾病的干细胞治疗理想的细胞之一。在我们研究的早期阶段，我们申请了一种三步分离方法来富集FLSPCs，并获得与流式细胞分选方法相似的分离效率。并且，使用暴发性肝衰竭大鼠模型，我们证明FLSPCs可以促进肝形态发生和功能的恢复。

业已证实，胎肝干细胞是一种双向分化潜能的多能干细胞。在适当的信号通路的调节下，肝干细胞可以分化为成熟的肝细胞和胆管细胞。从而完成肝脏的损伤修复。胎肝干细胞能表达干细胞表面标志物，如CD133、EpCAM、CD49f、Dlk1、CD13等。肝干细胞体外能长期培养而保持染色体组型的稳定性不变，且其增殖分化潜能明显高于其他来源的干细胞。早期研究已证实：Wnt信号通路调控肝干细胞向肝细胞分化，而Notch信号通路则促进肝干细胞向胆管系分化，Notch信号是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育的重要通路。Notch基因的配体Jagged1由Thy1+的肌纤维母细胞产生，并与肝干细胞上的受体作用从而活化下游信号通路，促进肝干细胞向胆管细胞分化。于此相反，Wnt信号分子作用于肝干细胞诱。

导β-链蛋白信号并同时表达Notch信号途径的抑制物，最终导致肝干细胞向胆管细胞分化的Notch信号通路受抑制，向肝细胞分化受促进。Notch信号途径是人体最重要的信号转导通路之一，其分子广泛表达于胚胎和成年个体组织中，主要由表达于相邻细胞上的Notch配体和Notch受体、以及表达于细胞内的转录因子、下游分子和其他调节分子组成。RBP-J是激活Notch信号通路所必需的一个核心转录因子，它的缺失意味着Notch信号的完全阻断。Notch信号途径对细胞的分化、增殖、凋亡有重要的调控作用，它广泛参与组织器官的发育、生长以及再生进程，其功能的异常与很多疾病及肿瘤发生有关。我们前期研究发现，肝再生的进程伴有Notch信号通路分子的广泛变化。Notch信号途径对于维持肝脏的稳态具有重要作用。然而，仍有一个问题需要解决，以探索FLSPCs的治疗潜力。

首先，如何准时诱导干细胞分化为肝细胞仍然是一个挑战。研究显示：Notch信号在调节许多类型的干细胞的分化和自我更新中起着关键作用。我们早期研究发现，Notch信号在FLSPC向肝细胞分化中发挥重要作用。然而，在从胎儿肝干/祖细胞分化为(FLSPCs)成熟的肝细胞的过程中Notch的作用，尤其是主要的Notch受体的作用是未知的。因此，需确定主要的促进FLSPCs分化的特异性Notch受体。同时，在组织水平和细胞水平上，我们发现与成人成熟肝脏和BRL细胞相比，Notch3是在胚胎14日的胎肝和FLSPCs中唯一表达较多的。