[发明专利]检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及方法在审
| 申请号： | 201811173335.8 | 申请日： | 2018-10-09 |
| 公开（公告）号： | CN109234420A | 公开（公告）日： | 2019-01-18 |
| 发明（设计）人： | 张震;赵玉玺;闫跃飞;闫磊;刘星;王利宁;薛永康;李静茹;皇超英;李华民;赵新芳;任小丽;刘欢;白雪利;刘文静;刘晓曼;刘长磊;张林雪;陈军慧;王康斌;潘磊;连真真;刘向寰;李振亚;栗敏杰 | 申请（专利权）人： | 河南省奶牛生产性能测定中心;郑州市畜牧技术推广站;河南乾祥农牧科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6893 | 分类号： | C12Q1/6893;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/90 |
| 代理公司： | 北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司 11385 | 代理人： | 董芙蓉 |
| 地址： | 450046 河*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 微小隐孢子虫 探针 荧光定量PCR引物 试剂盒 检测 检测试剂 分子生物学技术 病原 淬灭荧光基团 荧光定量PCR 报告荧光 特异性强 缓冲液 灵敏性 种检测 甘油 研发 引物 | ||
1.检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物，其特征在于，所述引物的序列为：
上游引物：TTAGACGGTAGGGTCG；
下游引物：GCAAATTACCCAATCCTAA。
2.检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR探针，其特征在于，所述探针的序列为：
CY5-TAAGGAAGGCAGCAG-BHQ1。
3.检测微小隐孢子虫的探针荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的PCR引物和权利要求2所述的PCR探针。
4.如权利要求3所述的检测微小隐孢子虫的探针荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：Tris-HCl缓冲液、KCl、MgCl2、dNTP、DMSO、甘油、UDG酶、Taq酶。
5.如权利要求4所述的检测微小隐孢子虫的探针荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用25μL体系；所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.3，浓度为1-10mmoL/L；所述KCl的浓度为30-50mmoL/L；所述MgCl2的浓度为0.1-2.5mmoL/L MgCl2，所述dNTP的浓度为0.1-0.2mmoL/L；所述上游引物和所述下游引物的浓度均为0.1-10mmoL/L，所述探针的浓度为0.1-5mmoL/L；所述DMSO的浓度为1-5％；所述甘油的浓度为2-5％；所述UDG酶的酶活力为0.1-0.4U；所述Taq酶的酶活力为0.1-1U；所述试剂盒可在100分钟内完成微小隐孢子虫检测。
6.如权利要求是3-5任一项所述的检测微小隐孢子虫的探针荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：将探针、上、下游引物、DNTP、Taq聚合酶制成干粉状加入到定量的检测管中；向检测管中加入已提取好的待检核酸，用水补齐至所述检测管的预设刻度线；盖上所述检测管的管盖并放入荧光PCR仪中进行反应。
7.如权利要求是6所述的检测微小隐孢子虫的探针荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述PCR的反应条件：第一阶段设计为95℃，5min；第二阶段设计为95℃，10s，60℃，45s，40个循环，并在60℃时采集荧光。
8.如权利要求是7所述的检测微小隐孢子虫的探针荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法的结果判定：
当检测结果呈现无Ct值，无扩增曲线或反应曲线无明显对数期判定为阴性；
当检测结果出现Ct值＜35，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光PCR阳性；
当检测结果出现Ct值35＜Ct值＜40，则需要样品重测；
当复测的Ct值＜40，且扩增曲线有明显的对数增长期，则判定为阳性。
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