[发明专利]检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及方法，涉及分子生物学技术领域。本发明的检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物序列为SEQ ID NO.1和2，荧光定量PCR探针序列为SEQ ID NO.3；所述探针的报告荧光基团CY5，淬灭荧光基团为BHQ1。本发明的检测试剂盒包括：上述引物对、探针、Tris‑HCl缓冲液、KCl、MgCl₂、dNTP、DMSO、甘油、UDG酶及Taq酶；所述试剂盒可在100分钟内完成微小隐孢子虫检测。本发明研发的检测试剂盒为微小隐孢子虫病原提供了新的检测方法，操作简单、灵敏性和特异性强。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及法一种检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

微小隐孢子虫(学名：Cryptosporidium parvum)是引起隐孢子虫病的其中一种病原寄生虫，主要寄生在哺乳动物的肠道，尤其流行于反刍动物中，除了牛以外，能传播微小隐孢子虫的还有啮齿动物、羊和家养宠物等，除了动物传播外，还可能通过粪污染传染至人类。其感染的主要途径是饮用了含小隐孢子虫卵囊(Oocysts)的水所引起。症状通常于感染后7天左右出现，包括腹痛、水泻、呕吐及发热。大部分患病后的病症持续6-10天，但也有可能会持续数星期。免疫功能低下患者病情可能非常严重，甚至威胁生命。目前认为已发现的隐孢子虫至少有6种，人和哺乳动物的隐孢子虫感染几乎都是由微小隐孢子虫所引起。临床表现包括急性胃肠炎型和慢性腹泻型。

微小隐孢子虫也是引起断奶前犊牛发生腹泻的主要病原之一，常规检测微小隐孢子虫方法包括形态学鉴定、酶联免疫吸附实验、巢式PCR等方法。随着荧光定量PCR技术在分子生物学领域的应用为病原检测带来了新的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及方法，主要目的是提供一种操作方便、灵敏度和特异性高的新的检测方法。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物，所述引物的序列为：

上游引物：TTAGACGGTAGGGTCG；

下游引物：GCAAATTACCCAATCCTAA。

另一方面，本发明实施例提供了一种检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR探针，所述探针的序列为：CY5-TAAGGAAGGCAGCAG-BHQ1。

又一方面，本发明实施例提供了一种检测微小隐孢子虫的探针荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括上述PCR引物和上述PCR探针。

作为优选，所述试剂盒包括：Tris-HCl缓冲液、KCl、MgCl₂、dNTP、DMSO、甘油、UDG酶、Taq酶。

作为优选，所述试剂盒采用25μL体系；所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.3，浓度为1-10mmoL/L；所述KCl的浓度为30-50mmoL/L；所述MgCl₂的浓度为0.1-2.5mmoL/L MgCl₂，所述dNTP的浓度为0.1-0.2mmoL/L；所述上游引物和所述下游引物的浓度均为0.1-10mmoL/L，所述探针的浓度为0.1-5mmoL/L；所述DMSO的浓度为1-5％；所述甘油的浓度为2-5％；所述UDG酶的酶活力为0.1-0.4U；所述Taq酶的酶活力为0.1-1U；所述试剂盒可在100分钟内完成微小隐孢子虫检测。

作为优选，所述方法包括：将探针、上、下游引物、DNTP、Taq聚合酶制成干粉状加入到定量的检测管中；向检测管中加入已提取好的待检核酸，用水补齐至所述检测管的预设刻度线；盖上所述检测管的管盖并放入荧光PCR仪中进行反应。