[发明专利]一种农杆菌质粒DNA的提取方法

权利要求书

1.一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）农杆菌菌液培养：

挑取转化后的农杆菌单菌落投入到4~5mL带有卡那霉素的YEB液体培养基中，然后将YEB培养基置于摇床中进行震荡培养，在振荡培养的同时进行超声波处理；

（2）菌体收集：

等到步骤（1）中菌液的OD值达到1.2~1.3时，将菌液置于离心机中进行分步离心处理，首先是以6000~7000rpm的转速离心1~2min，弃上清，然后以3000~4000rpm的转速离心1~2min，弃上清得菌体；

（3）农杆菌细胞破裂：

量取320~350mL预混液置于步骤（2）装有菌体的离心管中，然后加入0.9~1mL溶菌酶，再用无菌的均质机进行均质处理30~40s后，上下颠倒离心管直至菌体完全溶解，最后置于-2~0℃环境中进行放置4~6min；

（4）质粒DNA的提取：

a. 将步骤（3）中破裂后的细胞溶液置于离心机中进行离心处理，离心机的转速为11000~13000rpm，离心处理7~8min后，取上清置于新的无菌离心管中，然后向新的无菌离心管中加入与上清等体积预冷的无水乙醇，混匀后置于-50~-40℃的环境中放置3~5min；

b. 将操作a中的混合液置于离心机中进行离心处理，离心机的转速为11000~13000rpm，离心4~5min后，弃上清；

c. 量取60~80mL TE Buffer溶液置于操作b的离心管中，轻弹离心管的底部，直至沉淀完全溶解即可。

2.根据权要求1所述一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中震荡培养的条件为：摇床的转速为160~180rpm，摇床内的温度控制为28~32℃。

3.根据权利要求1所述一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中超声波的频率为34~38kHz。

4.根据权利要求1所述一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中均质机的工作压力为30~40MPa。

5.根据权利要求1所述一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中预混液的制备方法是：将SolutionⅠ、SolutionⅡ按照体积比为1:1.6~1.8共同置于离心管中，混匀后置于2~4℃环境中进行放置10~14min，然后量取SolutionⅠ和SolutionⅡ总体积30~40%的SolutionⅢ投入离心管中，摇匀后置于-1~2℃的环境中放置备用。

6.根据权利要求5所述一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述SolutionⅠ中各成分及对应重量份为：45~55mmol/L葡萄糖6~7份、20~30mmol/L三（羟甲基）氨基甲烷2~3份、8~12mmol/L 乙二胺四乙酸1~2份。

7.根据权利要求5所述一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述SolutionⅡ中各成分及对应重量份为：0.2~0.3mol/L氢氧化钠5~6份、0.9~1.1%十二烷基硫酸钠5~6份。

8.根据权利要求5所述一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述SolutionⅢ中各成分及对应重量份为：1~2mol/L醋酸钾6~7份、冰乙酸0.3~0.4份、蒸馏水3~4份。

9.根据权利要求1所述一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（4）操作c中各成分及对应重量份为：8~12mmol/L三（羟甲基）氨基甲烷4~5份、0.1~0.2mmol/L 乙二胺四乙酸3~4份。