[发明专利]一种农杆菌质粒DNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌质粒DNA的提取方法，包括如下步骤：（1）农杆菌菌液培养；（2）菌体收集；（3）农杆菌细胞破裂；（4）质粒DNA的提取。本发明提供了一种农杆菌质粒DNA的提取方法，方法科学合理，缩短了提取的时间，提高了提取的效率，提高了质粒DNA的纯度和含量，并且安全性高，具有很好的市场推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农杆菌质粒DNA的提取方法。

背景技术

农杆菌质粒DNA的提取和检测在植物基因工程研究中是必需的试验，也是在分子生物学试验中一项常规技术。农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统。农杆菌分为根瘤农杆菌和发根农杆菌。根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导（T）质粒,Ti质粒上含有可转移DNA（T-DNA）区、毒性区（Vir区）以及冠瘿碱代谢基因编码区。T-DNA两端是两个25bp的重复序列，分别称为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因。Vir区中也含有多个基因段，如FiM、FirB、FirC、VirD.、VirE、VirG、VirH等，每个基因段都含有多个基因。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因，chvA、chvB等介导的趋化性促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面；另一方面则被Ti质粒上由VirA和VirG组成的双组分调节系统识别，从而诱导其他Vir的表达。VirD1和VirD2共同作用，由T-DNA右边界开始向左边界切割产生—条T-DNA单链，并与Vir其它表达蛋白结合成复合体转移到农杆菌外，然后进入细胞到达细胞核内并整合到细胞染色体上。

转基因植物在近代工业、医药业、特别是农业等各个领域的研究和应用越来越为人类所重视。通过农杆菌对植物植株、器官、组织及细胞的侵染进行质粒转化，是将外源基因导入目的植物的重要方法之一。将外源基因人为导入天然植物中，从遗传物质水平上对植物进行有目的改造，由此获得转基因植物，其性状将按着有利于人们需要的方向发生改变。如转基因的抗虫棉花，通过人们的改造，使棉花在生长过程中体内能够自主地产生抵抗害虫的毒素，以达到自我保护、减少农药使用增产增收的目的。

为了更好地将外源基因导入目的植物，需要研制一种提取农杆菌质粒DNA的方法。常规的农杆菌质粒DNA的提取方法通常涉及的程序比较复杂，所使用的试剂多比较昂贵，并且农杆菌的提取率非常低，极大的限制了基因工程的发展。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其方法科学合理，缩短了提取的时间，提高了提取的效率，提高了质粒DNA的纯度和含量，并且安全性高，具有很好的市场推广应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种农杆菌质粒DNA的提取方法，包括如下步骤：

（1）农杆菌菌液培养：

挑取转化后的农杆菌单菌落投入到4~5mL带有卡那霉素的YEB液体培养基中，然后将YEB培养基置于摇床中进行震荡培养，在振荡培养的同时进行超声波处理；

（2）菌体收集：

等到步骤（1）中菌液的OD值达到1.2~1.3时，将菌液置于离心机中进行分步离心处理，首先是以6000~7000rpm的转速离心1~2min，弃上清，然后以3000~4000rpm的转速离心1~2min，弃上清得菌体；

（3）农杆菌细胞破裂：

量取320~350mL预混液置于步骤（2）装有菌体的离心管中，然后加入0.9~1mL溶菌酶，再用无菌的均质机进行均质处理30~40s后，上下颠倒离心管直至菌体完全溶解，最后置于-2~0℃环境中进行放置4~6min；

（4）质粒DNA的提取：