[发明专利]基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法在审
申请号: | 201811182098.1 | 申请日: | 2018-10-10 |
公开(公告)号: | CN109402265A | 公开(公告)日: | 2019-03-01 |
发明(设计)人: | 杨宇泽;路永强;常卓;赵春颖;刘林;赵凤;吕小青;赵凤茹 | 申请(专利权)人: | 北京市畜牧总站;北京奶牛中心 |
主分类号: | C12Q1/6888 | 分类号: | C12Q1/6888;C12Q1/686 |
代理公司: | 北京汇智英财专利代理事务所(普通合伙) 11301 | 代理人: | 张玮玮 |
地址: | 100107 北*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 引物 突变基因 奶牛 上游 技术检测 乳球蛋白 基因型 制备 标签序列 产奶性状 混合引物 基因分型 基因检测 技术瓶颈 技术优势 下游引物 荧光标签 种质资源 重要意义 变异体 荧光 种源 突变 牧场 筛选 培育 健康 | ||
1.一种基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤S1:制备DNA样品;
步骤S2:制备好PCR扩增体系,其中,该扩增体系内包括50%体积分数的DNA样品、1.2-1.6%体积分数的混合引物,以及余量的KASP混合液;
步骤S3:进行PCR扩增;
其中,步骤S2中添加的混合引物包括三种KASP引物,分别为上游未突变基因引物、上游突变基因引物以及下游引物,并且,上游未突变基因引物及上游突变基因引物中分别设计有HEX荧光标签序列及FAM荧光标签序列,以通过根据PCR扩增后DNA样品的荧光强度,进行基因分型。
2.如权利要求1所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法,其特征在于,所述步骤S2中,所添加的混合引物包括两组,其用于分别检测两处突变位点的碱基类型,并且,针对不同的突变位点,设计的引物如下:
(1)所欲检测LG-118位点上的碱基类型时,引物包括:上游突变基因引物CACCCAGGCACTGGCAGG、上游未突变基因引物CCACCCAGGCACTGGCAGA以及下游引物AGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAA;
(2)所欲检测LG-64位点上的碱基类型时,引物包括:上游突变基因引物ATGATCTTCTTCTGAGCACACTCAC、上游未突变基因引物AATGATCTTCTTCTGAGCACACTCAT以及下游引物GAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAA。
3.如权利要求2所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法,其特征在于,检测相应位点上的碱基类型时,若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强度,则该位点上两条链均突变;若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度,则该位点上两条链均未突变;若扩增后DNA出现两种混合荧光强度,则该位点上两条链一条突变,一条未突变。
4.如权利要求1所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法,其特征在于,所述步骤S3中,PCR扩增的步骤包括:
步骤S31:在温度为90-95摄氏度时热激活14-16分钟,90-95摄氏度时变性18-22秒,65-50摄氏度时退火和延伸55-65秒,进行10个循环;
步骤S32:在温度为90-95摄氏度时变性18-22秒,60-50摄氏度时退火和延伸55-65秒,进行24-28个循环;
步骤S33:在温度为90-95摄氏度时变性18-22秒,60-50摄氏度时退火和延伸55-65秒,进行3个循环。
5.如权利要求4所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法,其特征在于,所述步骤S3中,PCR扩增的步骤包括:
步骤S31:在温度为94摄氏度时热激活15分钟,94摄氏度时变性20秒,61-55摄氏度时退火和延伸60秒,进行10个循环;
步骤S32:在温度为94摄氏度时变性20秒,55摄氏度时退火和延伸60秒,进行26个循环;
步骤S33:在温度为94摄氏度时变性20秒,57摄氏度时退火和延伸60秒,进行3个循环。
6.如权利要求1所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法,其特征在于,所述步骤S1中,DNA样品的提取方法包括:
步骤S11:对血液材料进行预处理;
步骤S12:先后通过Porteinase K溶液以及缓冲液GB消化血液材料,使溶液体系澄清;
步骤S13:添加缓冲液BD,充分混匀;
步骤S14:将溶液置于吸附柱CG2中,常温离心,弃废液;
步骤S15:加入缓冲液GDB,常温离心,弃废液;
步骤S16:加入缓冲液PWB,常温离心,弃废液,重复至少一次;
步骤S17:将最终获得的吸附柱CG2置于收集管中,常温离心,弃废液;
步骤S18:洗脱吸附柱CG2,进行DNA定量;
步骤S19:通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性。
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