[发明专利]基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法

权利要求书

1.一种基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1：制备DNA样品；

步骤S2：制备好PCR扩增体系，其中，该扩增体系内包括50％体积分数的DNA样品、1.2-1.6％体积分数的混合引物，以及余量的KASP混合液；

步骤S3：进行PCR扩增；

其中，步骤S2中添加的混合引物包括三种KASP引物，分别为上游未突变基因引物、上游突变基因引物以及下游引物，并且，上游未突变基因引物及上游突变基因引物中分别设计有HEX荧光标签序列及FAM荧光标签序列,以通过根据PCR扩增后DNA样品的荧光强度，进行基因分型。

2.如权利要求1所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所添加的混合引物包括两组，其用于分别检测两处突变位点的碱基类型，并且，针对不同的突变位点，设计的引物如下：

(1)所欲检测LG-118位点上的碱基类型时，引物包括：上游突变基因引物CACCCAGGCACTGGCAGG、上游未突变基因引物CCACCCAGGCACTGGCAGA以及下游引物AGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAA；

(2)所欲检测LG-64位点上的碱基类型时，引物包括：上游突变基因引物ATGATCTTCTTCTGAGCACACTCAC、上游未突变基因引物AATGATCTTCTTCTGAGCACACTCAT以及下游引物GAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAA。

3.如权利要求2所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法，其特征在于，检测相应位点上的碱基类型时，若扩增后DNA仅出现对应FAM荧光强度，则该位点上两条链均突变；若扩增后DNA仅出现对应HEX荧光强度，则该位点上两条链均未突变；若扩增后DNA出现两种混合荧光强度，则该位点上两条链一条突变，一条未突变。

4.如权利要求1所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法，其特征在于，所述步骤S3中，PCR扩增的步骤包括：

步骤S31：在温度为90-95摄氏度时热激活14-16分钟，90-95摄氏度时变性18-22秒，65-50摄氏度时退火和延伸55-65秒，进行10个循环；

步骤S32：在温度为90-95摄氏度时变性18-22秒，60-50摄氏度时退火和延伸55-65秒，进行24-28个循环；

步骤S33：在温度为90-95摄氏度时变性18-22秒，60-50摄氏度时退火和延伸55-65秒，进行3个循环。

5.如权利要求4所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法，其特征在于，所述步骤S3中，PCR扩增的步骤包括：

步骤S31：在温度为94摄氏度时热激活15分钟，94摄氏度时变性20秒，61-55摄氏度时退火和延伸60秒，进行10个循环；

步骤S32：在温度为94摄氏度时变性20秒，55摄氏度时退火和延伸60秒，进行26个循环；

步骤S33：在温度为94摄氏度时变性20秒，57摄氏度时退火和延伸60秒，进行3个循环。

6.如权利要求1所述的基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法，其特征在于，所述步骤S1中，DNA样品的提取方法包括：

步骤S11：对血液材料进行预处理；

步骤S12：先后通过Porteinase K溶液以及缓冲液GB消化血液材料，使溶液体系澄清；

步骤S13：添加缓冲液BD，充分混匀；

步骤S14：将溶液置于吸附柱CG2中，常温离心，弃废液；

步骤S15：加入缓冲液GDB，常温离心，弃废液；

步骤S16：加入缓冲液PWB，常温离心，弃废液，重复至少一次；

步骤S17：将最终获得的吸附柱CG2置于收集管中，常温离心，弃废液；

步骤S18：洗脱吸附柱CG2，进行DNA定量；

步骤S19：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性。