[发明专利]基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法

说明书

本发明涉及一种基于KASP技术检测β‑乳球蛋白基因型的方法，包括如下步骤：制备DNA样品；制备好PCR扩增体系；进行PCR扩增；PCR扩增体系中的混合引物包括三种KASP引物：上游未突变基因引物、上游突变基因引物以及下游引物，并且，上游未突变基因引物及上游突变基因引物中分别设计有HEX荧光标签序列及FAM突变荧光标签序列；根据PCR扩增后DNA样品的荧光强度，进行基因分型。本发明实现了对奶牛中BLG基因两种常见变异体的全面筛选，可充分利用基因检测等领域的资源与技术优势培育优质种牛，发掘奶牛特色种质资源，为牧场选择合适的奶牛，提高产奶性状，从种源解决相关领域的技术瓶颈，对奶牛良种产业健康发展具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法。

背景技术

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)是由乳腺上皮细胞合成的特有蛋白,普遍存在于驯鹿、猪、马、羊、猫和狗等多种哺乳动物的乳汁中。牛奶的乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成,分别约占牛奶总蛋白的80％和20％，而β-LG是乳清蛋白的主要成分，占乳清蛋白的50％，占总蛋白的12％。

研究乳蛋白基因多态性的主要目的是将其作为遗传标记应用到牛育种的辅助选择中去。牛的产奶性状是受多位点控制的数量性状,其遗传力一般为中等偏下，受环境影响大，而乳蛋白基因位点则是诸多对产奶性状有影响的基因位点中的一类。展望未来，从β-乳球蛋白研究现状可以看出分子遗传学方法在奶牛育种中的应用潜力很大,具有广阔的发展前景。

随着分子生物学技术和核酸技术的引入和发展，大量基于β-乳球蛋白基因的研究报道显示该基因多态性显著，编码β-LG蛋白的基因被称为BLG基因，在该基因座上发现A、B、C、D、E、F、G、H和W9种变构体。牛乳中β-乳球蛋白主要存在A、B两种遗传变异体，导致这两处碱基替换的位点分别位于BLG基因的第3和第4外显子。研究证明不同变异体对奶牛牛乳的组分、性质和产量有一定的影响，还发现β-Lg基因多态性对荷斯坦牛生产繁殖也有影响。B变异体为优势基因型，起正向改良作用。

目前检测β-酪蛋白基因型的方法有酶切、测序、荧光定量PCR技术等，但以上方法费事、费力且成本高。

发明内容

有解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于KASP技术检测β-乳球蛋白基因型的方法，包括如下步骤：

步骤S1：制备DNA样品；

步骤S2：制备好PCR扩增体系，其中，该扩增体系内包括50％体积分数的DNA样品、1.2-1.6％体积分数的混合引物，以及余量的KASP混合液；

步骤S3：进行PCR扩增；

其中，步骤S2中添加的混合引物包括三种KASP引物，分别为上游未突变基因引物、上游突变基因引物以及下游引物，并且，上游未突变基因引物及上游突变基因引物中分别设计有HEX荧光标签序列及FAM荧光标签序列，以通过根据PCR扩增后DNA样品的荧光强度，进行基因分型。

其中，所述步骤S2中，所添加的混合引物包括两组，其用于分别检测两处突变位点的碱基类型，并且，针对不同的突变位点，设计的引物如下：

(1)所欲检测LG-118位点上的碱基类型时，引物包括：上游突变基因引物CACCCAGGCACTGGCAGG、上游未突变基因引物CCACCCAGGCACTGGCAGA以及下游引物AGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAA；

(2)所欲检测LG-64位点上的碱基类型时，引物包括：上游突变基因引物ATGATCTTCTTCTGAGCACACTCAC、上游未突变基因引物AATGATCTTCTTCTGAGCACACTCAT以及下游引物GAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAA。