[发明专利]一种南极磷虾中虾青素单酯参考物质的制备方法

说明书

本发明提供了一种南极磷虾中虾青素单酯参考物质的制备方法。将冰冻南极磷虾冻干、研磨，获得含有天然虾青素的南极磷虾粉原料，利用冷丙酮提取，减压浓缩后通过溶剂分级去除水溶性脂质，采用硅胶柱层析进行分离纯化收集，经浓缩、冻干后，可以得到虾青素单酯。本方法制备的虾青素单酯，均匀性和稳定性良好，可为南极磷虾虾青素单酯的检测提供参考物质，可用于相应功效产品评价、开发研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种南极磷虾中虾青素单酯参考物质的制备 方法。

背景技术

虾青素，化学名称：3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-β,β'-胡萝卜素，英文名称：Astaxanthin，CAS：7542-45-2，分子式：C40H52O4，相对分子质量为596.86Da， 是一种类胡萝卜素衍生物，是目前已知的抗氧化性最强的天然抗氧化剂之一，具 有抗氧化等多种生物活性，在化妆品、保健品和医药工业中具有广泛的应用前景。 南极磷虾是虾青素的重要生物来源，超过90％以虾青素酯的形式存在，脂肪酸的 羧基可以和虾青素共轭双键末端的羟基结合形成酯，根据结合的脂肪酸的数量， 可以分为虾青素单酯和虾青素单酯。相关研究表明南极磷虾中虾青素单酯占 25％～35％，双酯占55％～64％。南极磷虾油作为新资源食品，急需制备参考物质 对虾青素酯的组成和含量进行准确测定。

目前我国缺少南极磷虾中虾青素单酯参考物质的制备方法，无法对虾青素单 酯的组成和含量进行准确测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种南极磷虾中虾青素单酯参考物质的制备方法，本 发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

1)取冰冻南极磷虾冻干后磨粉，获得含有天然虾青素的南极磷虾粉原料； (该步骤可以确保磷虾中虾青素酯的组成不变)

2)按照1:5的料液比，采用冷丙酮超声波提取20分钟，抽滤过膜后，减压 浓缩，在浓缩后的样品中加入3倍体积的异丙醇溶解，然后加入等体积的蒸馏水， 混匀后，放入-20℃冰柜中静置过夜，取上层溶液，减压浓缩后，用少量石油醚 溶解，待净化；(该步骤可以去除水溶性脂质干扰)

3)称取200～300目的硅胶，120℃活化4h，冷却至室温后在石油醚中浸泡 过夜，采用湿法装柱，层析柱规格5cm×60cm，硅胶用量为上样量的30倍， 层析柱用石油醚冲洗1h，待硅胶柱高度不变后，将待净化的样品倒入，先用一 半柱体积的石油醚淋洗，然后用一倍柱体积的2％丙酮-石油醚淋洗，最后用5％ 丙酮-石油醚淋洗，收集第二条红色色带，浓缩后冻干，即得虾青素单酯；(该步 骤可以纯化虾青素单酯，去除甘油三酯和游离脂肪酸等杂质的干扰)

4)准确称取少量上述冻干后的虾青素单酯，采用丙酮溶解后定容，采用液 相色谱法，低温皂化过夜，将虾青素单酯全部转化为游离态虾青素后，计算总虾 青素含量；(该步骤用于总虾青素的含量测定)

5)采用正相液相色谱，利用手性色谱柱确定虾青素的立体结构组成；(该步 骤用于虾青素立体结构的组成分析)

6)采用液相色谱-串联质谱/高分辨质谱(LC-HRMS)技术，解析虾青素单 酯的脂肪酸结构，鉴定了9种虾青素单酯，测定每种虾青素酯的质量百分含量， 得到虾青素单酯参考物质的纯度定值。(该步骤用于虾青素单酯组成和定量测定)

本发明解决的问题：发明了制备南极磷虾中虾青素单酯参考物质的方法，并 对虾青素单酯的结构、组成和含量进行了确定。本发明的有益效果是能作为参考 物质用于海洋资源中活性物质的检测，为在保健食品、医药和饲料等领域的应用 提供技术支持与物质保证。

附图说明

图1是液相色谱法测定总虾青素含量谱图；

图2是虾青素光学异构体的组成谱图。

具体实施方式