[发明专利]一种PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种构建人源化非人动物模型的方法，其特征在于，所述人源化非人动物模型基因组中含有人PD-1基因的编码序列或重组DNA片段，所述的人PD-1基因的编码序列或重组DNA片段通过非人动物内源性调控元件调控，所述的重组DNA片段包括编码胞外结构域、跨膜区和胞内结构域的序列，其中，重组DNA片段中编码胞外结构域的序列包含编码人PD-1蛋白序列的部分，重组DNA片段中编码胞内结构域和跨膜区的序列包含编码非人动物PD-1蛋白序列的部分，所述的构建方法包括将所述的人PD-1基因的编码序列或重组DNA片段导入非人动物PD-1的第1号外显子位置，使得人源化非人动物模型体内表达人或人源化PD-1蛋白，所述的人PD-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示，所述的人源化PD-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示，所述的非人动物为小鼠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人源化非人动物模型基因组中还含有辅助序列，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA；所述的辅助序列与人PD-1基因的编码序列通过序列拼接或所述的辅助序列与所述的重组DNA片段通过序列拼接。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行PD-1基因人源化非人动物模型的构建，所述基因编辑技术选自利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术或归巢核酸内切酶。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人PD-1基因的编码序列或重组DNA片段在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人或人源化PD-1蛋白，同时消除或降低了非人动物或其子代的内源的PD-1蛋白的表达。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用sgRNA靶向小鼠的PD-1基因，所述的sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：16所示。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的人源化非人动物模型基因组中包含嵌合PD-1基因，所述的嵌合PD-1基因表达人或人源化PD-1蛋白，所述的嵌合PD-1基因选自下列组中的一种：

a）所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因的DNA序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示；

b）所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列，所述的人PD-1基因的编码序列如SEQ ID NO：3所示；

c）所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因的DNA序列如SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示；

d）所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段，所述的重组DNA片段如SEQ ID NO：4所示；

或，e）所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因的mRNA序列如SEQ ID NO：34所示。

7.一种靶向载体，其包含：a）与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，所述的5’臂序列如SEQ ID NO：7所示；b）插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的插入或替换的供体DNA序列片段来自人，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：3或SEQID NO：9或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：39所示；c）与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，所述3’臂序列如SEQ ID NO：8所示；其中，所述的供体DNA序列为人PD-1基因的编码序列，或人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，或重组DNA片段，或重组DNA片段、WPRE及polyA；所述的重组DNA片段中编码胞外结构域的序列包含人PD-1基因序列的部分，以及编码跨膜区和胞内结构域的序列包含动物PD-1基因序列的部分。

8.根据权利要求7所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Pd-1基因的第1号外显子。