[发明专利]一种PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种人源化动物模型的制备方法，利用同源重组的方式将人PD‑1基因的编码序列导入动物基因组中，从而制备出基因修饰人源化动物，该动物体内能正常表达人或人源化PD‑1蛋白，可以作为人PD‑1、PD‑L1等信号机理研究、调节剂筛选、毒理研究的动物模型，这对于研究人PD‑1、PD‑L1基因的功能，以及以PD‑1、PD‑L1为靶点的新药研发具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于CRISPR/Cas9技术的PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

人源化动物模型是指带有人类功能性基因、细胞或组织的动物模型。这种模型通常作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。

研究人类复杂疾病的发病机制，筛选有效药物，需要理想的动物模型来进行大量的体内试验。小鼠是应用最为广泛的生物模型之一，但考虑到小鼠与人类在生理、病理等诸多方面存在差异，构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型尤为重要。利用基因修饰的方法，将人类基因“放置”在大鼠或小鼠染色体上所制备的人源化基因动物模型，可以在抑制动物内源基因表达的同时，获得表达人源基因的蛋白，是进行一些人类疾病机理研究和药物研发的重要方法。

肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，《Science》杂志将肿瘤免疫疗法评为2013年十大科学突破第一位。目前，针对PD-1/PD-L1通路抑制剂的研究受到了特别的关注。

PD-1(programmed death-1)主要表达于T细胞及初级B细胞表面，PD-1的两个配体(PD-L1和PD-L2)，广泛表达于抗原提呈细胞(APCs)等。PD-1与其受体的相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡，进而逃避免疫系统的攻击。抑制PD-1与其配体的结合，可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤视野，进而达到杀伤肿瘤组织及治疗癌症的作用。

目前有国内外很多大公司开始正在加紧开发抗PD-1药物。最熟悉的全球制药巨头当属BMS和默沙东，两家公司的Opdivo和Keytruda均已用于黑色素瘤和肺癌适应症治疗。2015年11月，FDA批准Opdivo用于晚期肾细胞癌，Opdivo头颈癌关键III期临床已成功完成。在2016年1月举办ASCO GI 2016上公布的结果显示，这两款药在管癌、胃癌显示积极疗效。在我国，2015年底，君实生物成为首家PD-1单抗获批临床的企业；2016年1月，百济神州的PD-1单抗BGB-A317通过FDA的新药研究申请审评，获准在美国开展临床试验；2月19日，恒瑞医药开发的注射用SHR-1210(PD-1单克隆抗体)获得药物临床试验批件，主要适应症为实体瘤；2月22日，沃森生物发布公告称，其子公司嘉和生物研发的抗PD-1单抗(杰诺单抗注射液)产品临床研究申请获得受理，主要的潜在适应症包括各种血癌及黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等多种实体瘤。截止2016年3月，国内已有两家PD-1单抗药物获得了临床试验批件，另有两家正在受理中。

药厂之间激烈的竞争表明了对该类药物高度认同，PD-1抑制剂可能成为医药史上一个重要的里程碑。美国国家癌症研究所(NCI)将PD-1列为140种癌症免疫治疗途径和分子中的第二最有前景的潜在靶点。

由于免疫疗法有较明显的免疫毒性，如皮炎、大肠炎、垂体炎等，这种副作用与免疫应答程度直接相关，很难通过剂量调整避免。PD-1单抗nivolumab、MK-3475都报道了肺炎这一严重不良反应，因此严格的药物筛选程序非常重要。但由于人类生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上，而人源化动物模型则能很好地“复制”人类某些功能，这种模型通常被用做人类疾病体内研究的活体替代模型。人源化动物模型的应用很广泛，比如在肿瘤、艾滋病、传染病、人类退化性疾病、血液病研究领域等都有很强的适用性。