[发明专利]PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品

权利要求书

1.一种PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQID No.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒；

将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同；

采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。

2.根据权利要求1所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品，采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系，优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。

3.根据权利要求2所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大，且反应终点荧光值与初始荧光值的差值越大，则野生型探针和突变型探针的使用浓度越好。

4.根据权利要求1所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：将突变型模板和野生型模板按1:1000至1:10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品，采用数字PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍，则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。

5.根据权利要求1所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述野生型探针和突变型探针是MGB探针，所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团。

6.根据权利要求1所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述野生型探针的5’端为VIC基团，所述突变型探针的5’端为FAM基团。

7.一种采用如权利要求1所述的优化方法优化后的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测产品。

8.根据权利要求7所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测产品，其特征在于：所述上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度为900nM，所述野生型探针在反应体系中的终浓度为100nM，突变型探针在反应体系中的终浓度为200nM。

9.根据权利要求8所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测产品，其特征在于：所述野生型探针和突变型探针是MGB探针，所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团。

10.根据权利要求8所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测产品，其特征在于：所述野生型探针的5’端为VIC基团，所述突变型探针的5’端为FAM基团。