[发明专利]PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品

说明书

本发明涉及一种PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法，检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按一定的拷贝数比例配制成标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域。采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，确定背景阈值。通过本发明的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法优化后的检测产品准确度更高。

技术领域

本发明涉及检测人类PIK3CA基因H1047R突变的数字PCR检测产品及其优化方法，属于生物技术领域。

背景技术

磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(PIK3CA)基因首次利用原位杂交技术，被鉴定为是染色体3q26.3上一段长度为34kb的基因。PIK3CA由20个外显子组成，编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的p110α催化亚基。PI3K是一类磷酸化肌醇脂3位羟基激酶，称为PI3Ks家族。I类PI3Ks是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异二聚体，由生长因之受体和胰岛素受体等激活，PI3Ks通常表达在胞质，产生拥有第二信使作用的肌醇类物质，在细胞的形态、活力、侵袭性、凋亡及细胞周期调控中起着重要的作用。PI3K-Akt(磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B)信号通路是调节细胞功能的重要信号途径，当PIK3CA基因以基因扩增或点突变的形式被激活是，其转录与翻译将升高，通过PI3K/AKT途径是AKT过度激活，无节制的促进细胞的生长和繁殖，同时会抑制细胞的凋亡，最终将导致肿瘤的发生。PIK3CA基因是一种原癌基因，其突变形式包括扩增、缺失和体细胞错义突变等。PIK3CA基因可在多种人类肿瘤中存在突变，导致PI3K信号途径在不同水平发生调控异常，其在结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤中发生高频体细胞突变。有研究指出PIK3CA基因突变，是除HER2基因扩增、p53基因突变之外乳腺癌常见基因突变之一，突变近80％发生在螺旋区和激酶区，分别对应PIK3CA基因的第9号外显子(E542K、E545D、E545K突变位点)和第20号外显子(H1047R、H1047L)。

携带有PIK3CA基因突变的患者对EGFR、HER2靶向药物治疗存在耐药性。例如，PIK3CA基因突变的乳癌患者对ErbB1/ErbB2双重酪氨酸激酶受体抑制剂拉帕替尼(TYKERB，商品名Tykerb)在内的常规HER2靶向治疗耐药。PIK3CA基因突变乳腺癌患者对Her2靶向药物注射用曲妥珠单抗耐药，PIK3CA基因突变结直肠癌患者对以EGFR为靶点的单克隆抗体西妥昔单抗产生耐药。因此，在癌症治疗过程中，对癌症患者进行PIK3CA基因的特定突变进行检测，是做到精准用药的关键，也可防止药物勿用带来的经济损失与治疗时间延误。

传统的针对对基因特定位点的突变检测常用的方法有一代测序和qPCR，但其灵敏度较低，因此需要具备高突变比例的组织标本进行检测，不适合实时检测监控。血浆游离DNA(cfDNA)是存在于血浆中的一种小片段DNA，平均长度在180bp，由体细胞产生释放进入血液。ctDNA是由肿瘤细胞释放进入血液的片段化DNA，因此，可通过检测ctDNA中的突变信息反应肿瘤细胞的突变信息。对cfDNA中的ctDNA的检测成为检测肿瘤突变的一种途径。cfDNA用于肿瘤突变检测优势在于操作无创，可实现实时检测和动态监测，克服肿瘤组织的异质性。然而，ctDNA所占cfDNA的含量极低，低于百分之一，传统检测方法无灵敏且准确的检测出血浆游离DNA中所包含突变信息。

数字PCR(dPCR)的出现革新了传统PCR检测的发展，极大的提高了检测的灵敏度。通过统计大量的单拷贝反应微滴，大大的提高了准确度和精密度。由于dPCR统计的是单个分子总数，理论上能做到每个反应单位为单拷贝模板。因此，数字PCR可以达到绝对定量。

发明内容