[发明专利]基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系

权利要求书

1.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系，其特征在于，包括扩增引物系统和分子信标探针系统，其中，所述扩增引物系统包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物对。

2.如权利要求1所述的体系，其特征在于，所述分子信标探针系统包括如SEQ ID NO.3所示的基因序列。

3.如权利要求2所述的体系，其特征在于，所述分子信标探针系统还包括用荧光团和淬灭基团标记SEQ ID NO.3所示的基因序列的5'和3'末端；

优选的，所述荧光团选自荧光素亚酰胺（FAM）、6-羧基荧光素、六氯- 6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、 磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的一种；

优选的，所述淬灭基团选自DDQ-I、DABCYL、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21和DHQ-3中的一种；

优选的，所述荧光团选自荧光素亚酰胺（FAM），所述淬灭基团选自DABCYL，分别标记SEQID NO.3所示的基因序列的5'和3'末端。

4.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒，包括上述任一权利要求所述的体系。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、Mg²⁺试剂、dNTPs、DNA Taq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH₂O)中的至少一种。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的使用浓度为10~100 pmol/L；优选50 pmol/L；

所述分子信标探针的使用浓度为20~100 pmol/L；优选50 pmol/L；

所述PCR反应缓冲液的成分包括KCl、Tris-HCl、1％TritonX-100，10×的PCR反应缓冲液的使用浓度为0.1~4.5 mmol/L；优选1.2 mmol/L，所述Mg²⁺试剂如MgCl₂试剂等，Mg²⁺的使用浓度为0.2~5 mmol/L；优选2.0 mmol/L；所述dNTPs中各dNTP的使用浓度为0.1~5 mmol/L；优选1.0 mmol/L；所述DNA Taq聚合酶的使用浓度为0.5单位。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还可含有阳性对照；优选，所述阳性对照为含有布鲁氏菌阳性对照质粒的溶液；

所述试剂盒中还可含有阴性对照；优选，阴性对照为各种不含有布鲁氏菌的溶液；再优选，阴性对照为PCR反应缓冲液、无菌水(ddH₂O)、生理盐水或含有非相关病原体对照质粒的溶液。

8.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的检测方法，包括如下步骤：

提取待测样本的DNA；

以提取的DNA作为模板，以所述扩增引物系统作为扩增引物，并加入分子信标探针系统进行实时荧光PCR扩增；

在实时荧光PCR扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增条件设置为：在95℃变性5分钟，在95℃条件下变性30秒，在55~65℃条件下退火30秒，在72℃下扩增30秒，PCR循环20~50次；

所述检测荧光信号的温度在30~50℃，优选在45℃下检测荧光信号。

10.如权利要求1-3任一所述的体系、权利要求4-7任一所述的试剂盒和权利要求8-9任一所述的检测方法在制备布鲁氏菌检测产品中的用途。