[发明专利]一种烟曲霉素的提取纯化方法

说明书

本发明公开了一种烟曲霉素的提取纯化方法，包括甲基叔丁基醚(MTBE)或乙基叔丁基醚(ETBE)发酵液萃取、MTBE或ETBE沉淀和结晶纯化等步骤。该方法操作简单、收率高、成本低廉、可大规模工业化生产，对烟曲霉素的产业化生产及后续烟曲霉素衍生物的开发具有重大意义。

技术领域

本发明涉及制药领域。具体的说，本发明涉及一种烟曲霉素的提取纯化方法。

背景技术

烟曲霉素(Fumagillin，式I)是从烟曲霉(Aspergillus Fumigatus)的发酵培养液中首次分离得到的具有多种生物活性的代谢产物。最初，烟曲霉素被用来杀死蜜蜂的微孢子虫寄生虫，后来发现可以用于治疗人肠道感染引起的微孢子虫病和(或)隐孢子虫病，而这种疾病对于免疫缺陷患者是相当致命的。另外，烟曲霉素几乎不溶于水，而且光照易降解，极大地影响了其生物利用，而研究人员发现烟曲霉醇等衍生物性质稳定，且效果好于烟曲霉素，而烟曲霉醇等相关衍生物是以烟曲霉素为原料制备而成。因此，如何大规模工业化生产纯度较高的烟曲霉素，对烟曲霉素及其衍生物产品的研究具有重大意义。

通过文献调研，目前，制备烟曲霉素的方法主要是通过发酵培养烟曲霉Aspergillus fumigatus，然后经过提取纯化得到烟曲霉素(Eble and Hanson,1951；McCowen et al.,1951)。公开的提取方法主要针对烟曲霉(产物主要在菌体的胞外，胞内也有一定的单位)的发酵产物获得，其提取方法都是先通过过滤去除菌体滤渣并获得滤液，然后对滤液进行进一步纯化获得烟曲霉素。

US2898268公开了发酵培养物经过过滤后得到滤液，滤液通过加入supercel助滤剂并调酸获得沉淀，沉淀用丙酮提取并浓缩至一定体积后再沉淀，然后将丙酮沉淀物用氯仿进行提取并浓缩至半固体状态，再溶解在甲醇中，将溶解液转入零下四十摄氏度中冷却过夜，收集粗的晶体，最后，将粗晶型溶解在热甲醇中，过滤并冷藏结晶，过滤并在真空下干燥，获得晶体。上述操作复杂且收率极低，仅为15.5％，不利于进行烟曲霉素的大规模工业化生产。

CN201610104785.6公开了一种使用大孔吸附树脂从烟曲霉的发酵液中提取纯化烟曲霉素的方法，该方法通过大孔吸附树脂及纯化，然后经过冷冻干燥获得针状晶体。其中一步树脂层析能够获得81.2％色谱纯度的晶体，需要二步树脂层析才能够获得95.2％色谱纯度晶体，操作步骤复杂；同时，烟曲霉素的水溶性非常差、对光和热极不稳定，层析周期长，易产生较多杂质；大孔吸附树脂需采用含水的溶剂洗脱，且需要较多的洗脱液，成本较高；综上可知上述方法不利于烟曲霉素的大规模工业化生产。

此外，上述所有工艺都是针对胞外烟曲霉素的提取工艺，没有考虑胞内烟曲霉素的提取情况。

综上，现有工艺都不能很好的满足烟曲霉素的大规模工业化生产的需求。因此，寻找一种操作简便、周期短、成本低、收率高、可大规模工业化生产的烟曲霉素的制备方法非常迫切。

发明内容

本发明保护了一种烟曲霉素的提取纯化方法，其特征在于，包括下述步骤:

步骤a):烟曲霉素发酵液经MTBE(甲基叔丁基醚)或ETBE(乙基叔丁基醚)搅拌、静置、分液，得到MTBE或ETBE萃取相；

步骤b):将步骤a)得到的MTBE或ETBE萃取相浓缩至原体积的1/30～1/40，然后降温、搅拌，过滤得到烟曲霉素湿固体；

步骤c):将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用有机溶剂①溶解、过滤得滤液①，滤液①在减压下搅拌，同时向滤液①中加入C₁-C₂醇，结晶8-12h过滤得到烟曲霉素粗品；优选地，所加入C₁-C₂醇的体积为滤液①体积的3～10倍；