[发明专利]一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法

权利要求书

1.一种布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、采集袭击现场的样本并进行处理；

S2、对处理后样本利用布鲁氏菌现场检测试剂盒进行实时荧光定量PCR检验，其中，布鲁氏菌现场检测试剂盒中包括阴性对照、阳性对照和布鲁氏菌属特异性上下游引物，将处理后样本、阴性对照及阳性对照分别作为底物在相同条件下进行同样的实时荧光定量PCR处理，对待测样品的检测结果进行分析，从而判断处理后样本是否带有布鲁氏菌。

2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，袭击现场采集的样本为擦拭样本、土壤样本或水样本；当袭击现场采集的样本为擦拭样本时，样本处理步骤为：

1)将带有擦拭样本的药棉棒头插入吸附柱，用移液枪向每个有棉棒的吸附柱中加入200μL的磷酸缓冲液，关闭收集管；

2)将收集管离心，8000rpm，离心3min后关闭收集管；

3)将收集管调温振荡，温度65℃，600rpm，震荡10min；

4)将收集管调温振荡，设置温度15℃，1400rpm后冷却至40℃以下用于检测；

当袭击现场采集的样本为土壤样本时，样本处理步骤为：

1)打开采样瓶，用勺子取大约1g土壤样本于离心管中；

2)使用移液枪吸取1mL超纯水到离心管中，将离心管离心，3000rpm离心5min，吸取上清液到新的离心管中；

3)再次离心，10000rpm离心30s吸取下层液体用于检测；

当袭击现场采集的样本为水样本时，样本处理步骤为：

1)打开采样瓶，使用移液枪吸取1mL样本到一个离心管中；

2)将离心管离心，3000rpm离心5min，取上清液转移到新的离心管中；

3)将新离心管10000rpm离心30s取最下层液体用于检测。

3.根据权利要求1所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，布鲁氏菌属特异性上下游引物的序列如下：

上游引物：qBSF1:5-GCCGATAAATCTTTCCCCCG-3，如SEQ ID NO：2所示；

下游引物：qBSR2:5-GCGGCAGGCTTAACACATGC-3，如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求3所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，布鲁氏菌现场检测试剂盒中还包括实时荧光定量PCR反应液Sybr Green pPCR mix，布鲁氏菌现场检测试剂盒中阴性对照为超纯水。

5.根据权利要求4所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR采用以下20μL反应体系：Sybr Green qPCR mix 10μL，上下游引物各0.8μL，布鲁氏菌属特异性上下游引物浓度均为10μmol·L^-1，超纯水7.4μL，底物1μL。

6.根据权利要求5所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃条件下预变性5min；94℃变性10s，退火延伸59℃，30s，扩增40个循环；扩增阶段温度变化速率20℃/s；每次在59℃末尾收集荧光信号。

7.根据权利要求6所述布鲁氏菌生物恐怖战剂现场基因检测方法，其特征在于，所述对待测样品的检测结果进行以下分析：通过扩增阶段荧光信号变化曲线图获得Ct值，通过Ct值对检测结果进行判断：若样品的Ct值≤t品，检测结果为阳性，样品中含有布鲁氏菌；

若样品的Ct值在28～30间，则对样品进行复检一次，若Ct值仍为28～30间，则检测结果为阴性；

若样品的Ct值为Negative或＞30，样品中布鲁氏菌低于检测限度，检测结果为阴性。