[发明专利]脐带间充质干细胞诱导分化形成皮肤成纤维细胞的方法

说明书

本发明公开了脐带间充质干细胞诱导分化形成皮肤成纤维细胞的方法，通过在无菌条件下脐带组织块，培养后得到脐带间充质细胞，再将脐带间充质细胞定向诱导分化为皮肤成纤维细胞，最终得到皮肤成纤维细胞，本发明取材容易，少量脐带即可获取大量具有活性的MSCs细胞，通过体外诱导分化形成皮肤成纤维细胞。本方法适宜大规模培养，对机体损伤小,无免疫排斥等优点，并且取材来源广泛，体内储备量大，适宜机体治疗或其它用途；培养过程较为简单，操作容易，成本较低，适合皮肤大面积损伤患者的辅助治疗。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体是脐带间充质干细胞诱导分化形成皮肤成纤维细胞的方法。

背景技术

皮肤是人体最大、最复杂的器官，包括表皮、真皮、皮下组织和汗腺、皮脂腺等附属结构。它覆盖全身，将机体与外部环境隔离开，有效地保护了身体内的各个组织、器官等不受外界环境干扰，也保持了人体内水分不流失。此外，它还具有排汗、感觉及调节体湿等生物功能。皮肤直接与外界环境接触，因此在日常生活中最容易受到伤害。创伤、烧伤等都会引起皮肤缺损，尽管皮肤具有一定的再生能力和缺损修复功能，但一旦缺损超越了其自身修复极限，皮肤就无法正常愈合，影响美观，严重的则会引发感染，甚至死亡。一直以来，学者们都在探索修复皮肤缺损的方法，目前临床上所用的修复方法，包括自体皮肤移植、同种异体皮肤移植、异种皮肤移植和构建人工皮肤四种。自体皮肤移植能够有效治疗缺损，但对于大面积的创伤，自体皮肤供体有限，皮源供应不足，并且需要开辟第二术区，形成新的创伤，还会给患者增加痛苦。同种异体和异种皮肤移植则都避免不了免疫排斥反应和修复效果差等问题。因此，最有研究前景和意义的便是构建人工皮肤，即组织工程皮肤(TES,Tissue-engineered skin)。组织工程皮肤，是指结合工程学和细胞生物学技术，将体外培养的种子细胞，复合到具有三维空间结构的生物支架材料中，形成接近人体皮肤结构，且具有生物活性的人造皮肤。由此可见，种子细胞和生物支架材料是组织工程皮肤研究中必不可少的部分。

种子细胞是TES研究中的焦点，是组织能够再生的物质基础。理想的种子细胞应具有获取方便、体外快速增殖的特点。目前用作种子细胞的主要有表皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞及胚胎干细胞等。传统的研究大多是将自体或异体的表皮细胞和成纤维细胞作为种子细胞，然而，由于来源有限，其应用受到限制。因此，近年来，干细胞便成为了种子细胞研究的重点。MSCs是一类多能干细胞，来源非常广泛，包括骨髓、脂肪、骨骼、肌肉、膜腺等组织以及羊水、脐带血等。近年来，对MSCs的研究主要集中在来源于骨髓的间充质干细胞(BM-MSCs)和来源于脂肪的间充质干细胞。大量的实验表明，在特定的诱导环境下，BM-MSCs可以分化为三个胚层的多种組织，包括脂肪、骨、软骨等，并且在连续传代和冻存后仍具有多向分化潜能。应用自体MSCs进行皮肤损伤修复，可以明显地促进伤口的愈合，BM-MSCs在体内可以分化为表皮细胞。将BM-MSCs接种于基质材料上，并对裸鼠进行皮肤缺损修复，检测发现新生皮肤中Pan-cytokeratin和E-cadherin的表达有明显的升高，表明在体内MSCs也可以分化为表皮细胞，并能够应用于缺损修复。方利君等小型香猪为研究对象，将自体BM-MSCs体外扩増后回植到皮肤，发现回植的部分BM-MSCs可以分化为表皮细胞，表明BM-MSCs可以在皮肤微环境里直接分化为表皮细胞。Chang等指出，骨髓来源的BM-MSCs在CTGF的作用下，可以被定向诱导分化为成纤维细胞。North和Altman等发现，使用机械力进行周期性的刺激，也可以使骨髓来源的BM-MSCs分化为成纤维细胞。Brzoska等的实验发现，MSCs在全反式维甲酸的诱导下，可以分化为表皮细胞。Sivan等将MSCs诱导分化为成纤维细胞，检测发现诱导所得的细胞能够合成许多胞外基质蛋白，对皮肤缺损有着很强的修复作用。

TES可以有效地保护伤口，并能够促进结缔组织生长。然而到目前为止，仍然没有一种完全理想的TES问世。皮肤的结构、组成和功能是很复杂的，而现在所研制出来的TES产品，成本高昂、弹性差，与正常的皮肤相差甚远。临床试验的结果也显示，TES还有可能会发生移植效率低、癒痕增生、导致感染和引发炎症反应等一系列症状。

发明内容