[发明专利]低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法

权利要求书

1.一种低共熔溶剂整体柱酶反应器应用于酶解N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯的方法，其特征在于包括以下步骤：

一、低共熔溶剂整体柱的制备

1）毛细管整体柱的制备

将2.0 mg的自由基引发剂偶氮二异丁腈加入80μL的低共熔溶剂，294μL离子液体，超声5 min分散后，加入8.2μL、0.096 mmol的功能单体甲基丙烯酸、46μL、0.326 mmol的共聚单体甲基丙烯酸甲酯、18μL，0.058 mmol的交联单体二甲基丙烯酸乙二醇酯，超声15 min使其完全溶解；通入氮气10 min，用注射器将预聚合液注入毛细管中，两端密封，在53 ℃下反应1.5 h；反应完成后，乙腈洗去整体柱中残留的致孔剂离子液体、氯化胆碱-乙二醇和可溶性物质，氮气吹干备用；

2）低共熔溶剂整体柱酶反应器的制备

用20 mM pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液配制胰蛋白酶溶液10 mg/mL和三（2-羰基乙基）磷盐酸盐溶液1 mg/mL，两者体积比为1:10混合，25℃下反应3 h，然后在4 ℃下离心10 min，10000 rpm，以除去不溶物；取上清液加入1 mg/mL过硫酸铵和2 mg/mL N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，即为酶衍生液；

将酶衍生液注入1）中合成的毛细管整体柱，25 ℃下反应5 h，反应完成后用20 mM pH8.0的Tris-Hcl缓冲液冲洗柱子1 h以除去未反应的物质；将制得的整体柱4 ℃保存备用；

二、低共熔溶剂整体柱酶反应器的酶活性测定

为定量地得到低共熔溶剂整体柱酶反应器的酶活性，以米氏常数Km和最大酶反应速率Vmax表征酶反应器的性能：

米氏常数（K_m）和最大反应速度（V_max）由米氏方程计算得到，使用Linewaver-Burk作图法以1/V对1/[S]作图：

得到一条直线，直线在横轴上的截距为-1/Km，纵截距为1/V_max，求出K_m与V_max；

用上述合成低共熔溶剂整体柱酶反应器，以N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯为酶反应底物，在胰蛋白酶的作用下，底物被水解成苯酰酯-L-精氨酸，在214 nm处有紫外吸收；将N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯溶于20 mM pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液中，配成不同浓度溶液：0.1 mM,0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM, 6 mM；使用注射泵将底物注入毛细管酶反应器，收集流出液，使用高效毛细管电泳仪测定产物苯酰酯-L-精氨酸的峰面积；

低共熔溶剂酶反应器的有效长度为5 cm，高效毛细管电泳分析使用的为长50 cm，内径100μm的空毛细管，流动相为20 mM pH 8.0Tris-Hcl缓冲液，分离电压15 kV，检测波长214nm。