[发明专利]低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法

说明书

本发明涉及一种低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法。制备步骤：将自由基引发剂偶氮二异丁腈加入低共熔溶剂/离子液体中，超声分散后，加入功能单体甲基丙烯酸、共聚单体甲基丙烯酸丁酯、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，超声溶解后注入毛细管中，热引发合成整体柱，用三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐（TCEP‑HCl）试剂使胰蛋白酶中的双硫键还原为巯基，加入过硫酸铵和N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺制备酶衍生液，在室温下与整体柱反应固定到整体柱表面，进行酶解蛋白。整体柱结构稳定，对酶活性影响较低，可作为重复利用的新型酶反应器酶解蛋白溶液。本发明采用原位聚合法在毛细管内直接聚合，合成方法简便易行，操作简单，聚合时间较短，成本低廉，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法，即以低共熔溶剂为绿色致孔剂制备毛细管整体柱酶反应器以及其在酶解蛋白中的应用。

背景技术

蛋白质组学是一门用科学技术手段研究蛋白质组的科学，由整体出发分析细胞内动态变化的蛋白质。传统的溶液酶解蛋白质的方法存在酶解时间长，分析通量低，自水解的问题，难以用于微量蛋白样品分析。目前主要的酶反应器主要包括整体柱酶反应器，颗粒固定化酶反应器，开管酶反应器，其中整体柱酶反应器应用较为广泛。整体柱是在柱内通道通过原位聚合反应形成的连续整体多孔材料。根据整体柱酶反应器中单体的不同，其类型可分为有机整体柱酶反应器和无机整体柱酶反应器。有机整体柱酶反应器由于用化学反应固定酶，固化过程中会引起酶的空间构象变化，易导致酶活性下降，而无机整体柱酶反应器多用二氧化硅做整体材料，对比有机整体柱，制备不易，而且后续表面衍生步骤也较繁琐。

胆碱类低共熔溶剂是由一定化学计量比的季铵盐（氯化胆碱）与多元醇（乙二醇）混合构成的低共熔溶剂。低共熔溶剂本质上是一种离子混合物，通过几种不同熔点的化合物按一定比例混合后形成，其理化性质与离子液体十分相似，也有人称其为“新型离子液体”。而低共熔溶剂具有低毒性、可降解、制备简单、价格低廉的优点，而且合成过程中的原子利用率达100%。相比甲苯等传统致孔剂，是十分理想的绿色溶剂。

点击化学指通过小单元的拼接，形成高选择性的碳-杂原子键，反应条件简单，环境友好，有很强的立体选择性。“巯基-烯”点击反应以光引发自由基反应为催化剂，在特定的区域和官能团间反应，具有高度选择性。点击反应利用整体柱上的残余双键与胰蛋白酶的巯基反应将酶固定在整体柱上，是一种有效的酶固定方法，可避免在整体柱上二次接枝而影响通透性。

发明内容

本发明的目的是提供一种低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法。以低共熔溶剂为绿色致孔剂，提高整体柱的通透性，增加样品液的通量，以及最大程度的保留酶活性，保证酶解效率。通过原位聚合法制备毛细管整体柱，应用“巯基-烯”点击反应原理在整体柱表面固定胰蛋白酶，得到整体柱酶反应器。本发明采用原位聚合法在毛细管内直接聚合，合成方法简便易行，操作简单，聚合时间较短，成本低廉。本发明整体柱结构稳定，对酶活性影响较低，可作为重复利用的新型酶反应器酶解蛋白溶液，具有广泛的应用前景。

本发明提供的一种低共熔溶剂整体柱酶反应器是按下述具体方法步骤制备：

1）将氯化胆碱加入乙二醇中，油浴加热4小时后完全溶解，即得到氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂；其中，氯化胆碱与乙二醇的质量比为1:3。

2）将自由基引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）溶于步骤1）的低共熔溶剂与离子液体中超声混匀后，加入甲基丙烯酸（MAA）、甲基丙烯酸甲酯（BMA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）得到预聚合液，超声，通氮气除去溶液中溶解的氧。注入经γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)预处理的毛细管柱，65℃热聚合反应1.5小时，反应完全后通乙腈冲毛细管柱，去除未反应的试剂。

其中低共熔溶剂和离子液体为整体柱的致孔剂。