[发明专利]一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法

权利要求书

1.一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述的体外培养方法包括如下步骤：采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化后，使用移液器将消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，制成水牛睾丸单细胞悬液，再采用差异贴壁法处理水牛睾丸单细胞悬液，得到原代水牛精原干细胞样细胞；将原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每36-60h更换一次干细胞培养液，培养60-120h后，获得体外培养的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养。

2.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述水牛睾丸单细胞悬液的制备方法如下：采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化后，使用移液器将消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液。

3.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，采用差异贴壁法处理水牛睾丸单细胞悬液的步骤为：将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养9-12h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养25-60min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞。

4.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法其特征在于，所述的传代方法包括如下步骤：将在体外培养的水牛精原干细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为2-4的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入胰酶质量分数为0.01-0.1％的胰酶细胞消化液消化10-60s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养1.5-4h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养。

5.根据权利要求4所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法其特征在于，所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:5-20。

6.根据权利要求4所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法其特征在于，所述含有胎牛血清的IMDM培养液中，胎牛血清和IMDM培养液的体积比为0.5-1.5:8.5-9.5。

7.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化的步骤为：采用胶原酶消化液和DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的水牛睾丸组织进行消化50-120min，离心，弃上清，得到沉淀，再使用胰酶细胞消化液和DNA酶对沉淀进行消化10-30min，即得；

所述胶原酶消化液中胶原酶的浓度为10-30mg/ml；所述DNA酶消化液中DNA酶的浓度为0.5-2mg/ml；所述胰酶细胞消化液中胰酶的质量分数为0.1-0.5％。

8.根据权利要求7所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述胶原酶消化液的添加量为0.5-2ml/g水牛睾丸组织；所述每次DNA酶消化液的添加量为100-800μl/g水牛睾丸组织；所述胰酶细胞消化液的添加量为1-3ml/g水牛睾丸组织。

9.根据权利要求1-4任一项所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成。

10.根据权利要求9所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述的干细胞培养液中，KSR的体积分数为5-15％，Fetuin的体积分数为5-15％，NEAA的浓度为5-15μl/ml，Lipid mixture 1,Chemically Defined的浓度为5-15μl/ml，B-27的浓度为15-25μl/ml，GDNF的浓度为10-30ng/ml，GFRα1的浓度为50-150ng/ml，bFGF的浓度为5-15ng/ml，LIF的浓度为5-15U/ml，β-ME的浓度为0.05-0.15mmol/L。