[发明专利]一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法

说明书

本发明公开一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，将原代水牛精原干细胞样细胞放入含有水牛支持细胞的培养皿上，培养60‑120h，完成体外培养；在体外培养得到的的水牛精原干细胞样细胞中加入PBS缓冲液，收集表层细胞，在该表层细胞中加入胰酶细胞消化液消化10‑60s，再加入IMDM培养液终止酶消化反应，收集表层细胞，将第二次收集的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，培养1.5‑4h，取上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；本发明的体外培养及传代方法操作简便，安全可靠，重复性高，对于哺乳类动物的不孕不育治疗以及濒临灭绝物种资源的保护具有重要意义。

技术领域

本发明涉及基因工程、珍稀物种保存及细胞工程等领域，更具体的涉及一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法。

背景技术

精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是形成精子的前体细胞，在雄性哺乳动物体内，精原干细胞的增殖、分化为精子的发生提供着源源不断的动力，同时也保证了遗传物质在亲子代之间的有效传递。自1994年成功开展精原干细胞移植技术以来，精原干细胞的研究成为了一个热点，且近年来又成功建立了精原干细胞的体外培养方法。2011年，又在体外成功开展了小鼠的无血清无饲养层的培养体系，使小鼠的精原干细胞的体外培养迈上新台阶。

水牛作为华南地区的特有物种，以传统役用为主，其产奶、产肉等生产性能较低，已难以满足当前人们对畜牧产品的需求。因此，若能将水牛精原干细胞在体外分离纯化并成功进行的体外培养，再结合移植技术和相应的遗传育种技术，将能够得到大规模的优良水牛品系。目前尚未看到有关水牛精原干细胞的体外培养及传代方法。

由于确定某种细胞是否为起始干细胞十分困难，因此本申请人将具有水牛精原干细胞属性的细胞称为水牛精原干细胞样细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，所述的体外培养方法包括如下步骤：采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化后，使用移液器将消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，制成水牛睾丸单细胞悬液，再采用差异贴壁法处理水牛睾丸单细胞悬液，得到原代水牛精原干细胞样细胞；将原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每36-60h更换一次干细胞培养液，培养60-120h后，获得体外培养的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养。

优选地，所述水牛睾丸单细胞悬液的制备方法如下：采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化后，使用移液器将消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液。

优选地，采用差异贴壁法处理水牛睾丸单细胞悬液的步骤为：将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养9-12h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养25-60min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞。