[发明专利]筛选m6A去修饰酶抑制剂的核苷酸底物、试剂盒和方法

说明书

本发明涉及筛选m⁶A去修饰酶抑制剂的多核苷酸底物、试剂盒和方法。在存在或不存在m⁶A甲基化的情况下，本发明公开的多核苷酸底物、试剂盒和方法利用能够发生荧光共振能量转移(FRET)的荧光标记和淬灭标记在限制性内切酶处理后的荧光值变化检测和评价小分子化合物对去修饰化酶的抑制作用，进而筛选出符合要求的抑制剂。

技术领域

本发明一般地涉及RNA表观遗传修饰的去修饰酶抑制，并且具体地涉及检测m⁶A去修饰酶抑制剂效果以及筛选m⁶A去修饰酶抑制剂的核苷酸底物、试剂盒和方法。

背景技术

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列在不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传修饰包括DNA甲基化修饰 (5-甲基胞嘧啶，5mC)及其相关修饰(如5-羟甲基胞嘧啶，5hmC)、组蛋白修饰(如甲基化修饰、乙酰化修饰)和新近发现的RNA表观遗传学修饰(如N⁶-甲基腺嘌呤，m⁶A)。

m⁶A作为真核细胞丰度最高(占mRNA中腺嘌呤总量的0.1％-0.4％)的 mRNA修饰，已经发现在许多正常生物学过程中发挥重要的作用，如组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答等。一些研究表明m⁶A 去修饰酶(如FTO)与多种疾病的发生密切相关，因而研发更多m⁶A去修饰酶抑制剂可能有助于研发针对各种疾病的有效治疗方案，特别是将这些抑制剂和其它治疗药物联合使用，可能治疗目前对有效药物耐药的疾病种类。

在现有技术中，抑制剂效果的检测如图1中所示，首先进行m⁶A去修饰酶活性反应，然后利用限制性内切酶特异性切割限制性酶切位点的原理，即，其可以未经修饰的限制性酶切位点而不能切割经m⁶A修饰的限制性酶切位点，通过非变性聚丙烯酰胺(Native-PAGE)凝胶电泳对酶切片段大小进行分析，从而实现对m⁶A去修饰酶抑制剂的检测和筛选：在不存在抑制剂的情况下，DNA 片段具有一大一小两个条带；而在存在抑制剂的情况下，小的DNA条带的颜色较浅，并且随着抑制剂浓度的升高而变浅，由此可以判断抑制剂的效果，进而进行抑制剂小分子化合物的筛选。然而，现有技术的方案存在操作复杂、检测样品数少(通量低)、清晰度低、难以进行准确定量和比较等缺点。

因此，需要一种新的能够克服上述缺点的检测和筛选方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种带有荧光标记和淬灭标记的核苷酸底物，上述两种标记由于荧光共振能量转移(FRET)，体系荧光值降至最低。但是经过限制性内切酶作用后，发生去修饰化的双链断开，解除上述荧光共振能量转移(FRET)，进而能检测到很高的荧光；而未发生去修饰化的双链保持结合，继续呈现较低的荧光值。使用荧光值大小可以检测和评价小分子化合物对去修饰化酶的抑制作用，进而筛选出符合要求的抑制剂。

第一方面，本发明提供了一种双链多核苷酸底物，其含有至少一个限制性内切酶识别区，所述限制性内切酶识别区中含有至少一个修饰的碱基，并且所述修饰碱基的存在阻止与限制性内切酶识别区相对应的限制性内切酶对核酸底物的剪切；所述双链多核苷酸底物两条链分别标记有荧光发射基团和荧光淬灭基团,且荧光发射基团和荧光淬灭基团之间存在荧光共振能量转移。

本发明所述双链多核苷酸底物，其特征在于所述修饰的碱基为5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤等。

本发明所述双链多核苷酸底物，其特征在于所述限制性内切酶识别区为 GGATCC，其中的A为m6A，所述限制性内切酶为DpnII。

本发明所述双链多核苷酸底物，其特征在于荧光发射基团和荧光淬灭基团位于双链多核苷酸底物的一端，或分别位于双链多核苷酸底物的两端。