[发明专利]一种以磁性Fe3

说明书

本发明公开了一种以磁性Fe₃O₄‑多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法，属于生物工程技术领域。以两种功能性多糖菊粉和果聚糖作为吸附剂，利用化学共沉淀方法，合成磁性Fe₃O₄‑多糖微球。磁性Fe₃O₄‑多糖微球能够有效提高载体的稳定性以及酶负载量，兼具强磁响应性的优点，将其应用于果糖基转移酶的固定化。固定化酶重复反应6次后，剩余81％酶活。

技术领域

本发明涉及一种以磁性Fe₃O₄-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

蔗果低聚糖(Fructooligosaccharide，FOS)，又称低聚果糖，分子式为：G-F-Fn，n＝1-3(G 为葡萄糖，F为果糖)，是由1-3个果糖基通过β-2-1糖苷键与蔗糖中的果糖基结合的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖组成的混合物。

由于低聚果糖具有能够有效增殖双歧杆菌、促进肠胃功能、热量低、防止龋齿等有益功能，愈发受到人们青睐，故其工业化生产对人们身体健康以及国民经济化发展具有重要意义。工业上一般以蔗糖为底物利用果糖基转移酶(Fructosyltransferase，EC2.4.1.9，FTS)的转糖基作用得到低聚果糖，其反应机理如下：

G-F(蔗糖)→G(葡萄糖)+G-F(蔗糖)+G-F-F(蔗果三糖)+G-F-F-F(蔗果四糖)+ G-F-F-F-F(蔗果五糖)

目前国内工业化生产低聚果糖的技术主要是液体深层发酵法，这种方法发酵周期长，果糖基转移酶利用率低。而固定化酶法是一种在工业化酶促反应中被广泛使用的技术。固定化酶法凭借其众多优点如酶能被反复利用、可避免被代谢产物污染、降低生产成本成为研究热点。

目前固定化主要有吸附法、包埋法、共价结合等，采用的载体包括大孔树脂、海藻酸钠、有机新型材料等，交联剂的使用以及共价结合法可能造成酶的部分失活、酶催化微环境的改变，甚至导致其反应动力学发生变化。简单的吸附法不适用于大分子物质、不适用于多酶反应。包埋法不易于工业上的大规模生产，会造成产物与底物难分离、酶反应难控制的现象。

2005年，Iraj Ghazi等将果糖基转移酶共价固定在经过环氧基团活化的聚甲基丙烯酸酯聚合物上，固定化酶活达25.9U/g载体，低聚果糖浓度最高可达61.5％。但是这种固定化方法所需载体的前处理复杂，固定化酶活不高，酶活回收率有限。2014年，Ganaie等人采用壳聚糖珠和藻酸盐珠固定化果糖基转移酶，固定化酶活分别为25U/g载体和43U/g载体，所获得的低聚果糖浓度分别是42.79％和67.75％。这种方法采用构造稳定的基质对菌丝体进行包埋，以壳聚糖珠为载体的固定化酶再循环效率低，而以藻酸盐珠为载体的热稳定性还有待提高。因此，利用一些方法来帮助改善这些缺陷，应用改善后的固定化酶法生产功能广泛的有益物质比如低聚果糖，对于固定化酶的进一步应用有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种以磁性Fe₃O₄-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法，先制备果糖基转移酶和磁性Fe₃O₄-多糖微球，再用磁性Fe₃O₄-多糖微球固定化果糖基转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述多糖包括菊粉或果聚糖。

在本发明的一种实施方式中，所述制备果糖基转移酶的具体步骤包括：

(1)将黑曲霉发酵20-48h，抽滤收集湿菌体；

(2)用0.1-0.5mol/L、pH 5.0-7.0的柠檬酸-磷酸缓冲液清洗，所得菌体用上述缓冲液制成菌体悬浮液；

(3)破碎菌体，冷冻离心后取上清液；