[发明专利]用于检测无细胞的病原体特异性核酸的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于检测受试者中的病原体的靶核酸的方法。该方法包括(a)扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且产生双链DNA，并且(b)检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。还提供了用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的试剂盒。

本申请是申请号为201280026842.3、申请日为2012年4月2日、发明名称为“用于检测无细胞的病原体特异性核酸的方法和试剂盒”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2012/031814的国际申请的中国国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2011年4月1日的美国临时申请号61/470,774的优先权。

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年4月1日提交的申请号为61/470774的美国临时专利申请的优先权，其内容均通过引用全部并入本文，并可用于所有目的。

发明的技术领域

本发明总体涉及用于检测受试者中病原体的特异性核酸的方法和试剂盒。

发明背景

许多病原体的感染都会引起严重的疾病。对病原体的早期检测在和这些病原体相关的疾病的诊断和治疗中起重要作用。结核病是一种由各种分枝杆菌菌株(通常为一种结核杆菌)引起的常见感染性疾病。这种感染性疾病在许多情况下是致命的。结核病的明确诊断是通过微生物采样培养以识别在临床样本(如痰或脓)中的结核分枝杆菌而得出。其他测试，如放射显影(如，胸部X光检查)，结核菌素皮肤试验，以及伽玛干扰素释放试验(IGRA)可以得出一个非确定性的诊断。

聚合酶链式反应(PCR)技术已被用于检测样本(例如痰，尿，胃液抽吸物，脑脊液，胸膜液，血，并脓肿，骨髓，活检样本，切除的组织或支气管活检材料)中的结核分枝杆菌(TB)，以提供结核病的早期诊断。已经有报道在一项研究中从所有8例确诊的肺结核患者的外周血白细胞里检测到结核分枝杆菌的DNA。而在另一项研究中，41例确诊的结核病患者中有39例检测到结核分枝杆菌的DNA。请参见Schluger等，Lancet 344：232-3(1994)；Cordos等，Lancet 347：1082-5(1996)。然而，这些实验的结果遭到了其他使用血液PCR检测结核病的研究人员的批评。参见，Kolk等，Lancet 344：694(1994)；Palenque等，Lancet 344：1021(1994)；Aguado等，Lancet 347：1836-7(1996)。虽然在过去二十年中已经为使用“血液结核分枝杆菌PCR”方法检测结核病作出了巨大努力，但仍只获得了非常有限的成功。

在体内，大部分的核酸(如DNA和RNA)都存在于细胞内，但是也有少量的核酸被发现自由流动于个体的血浆中。这些DNA和RNA分子被认为是由接近死亡的细胞在分解过程中释放到血液中的。

通过检测来源于DNA病原体的靶RNA可以区分潜伏性感染和活动性感染。例如，通过检测来源于结核分枝杆菌(TB)的靶RNA可以区分活动性结核感染和潜伏性结核感染并用于结核病的诊断。循环核酸(CNA)是在血液中发现的DNA或RNA。自从可以通过孕妇外周血检测胎儿DNA，已经可以在宿主外周血中检测来源于肿瘤、异种移植、器官移植和寄生虫的无细胞DNA和RNA。作为一种非侵入性诊断方法，CNA检测已被尝试应用于各种临床状况的诊断。但是，它还没有被成功应用于高灵敏度和高特异性地检测病原体特异性循环核酸。

因此，仍然需要一种具有高灵敏度和高特异性的用于检测个体内病原体(例如，结核分枝杆菌)的早期检测方法。

发明概述

本发明涉及用于检测受试者中无细胞的病原体特异性核酸的方法及相关的检测试剂盒。