[发明专利]用于PCR阵列的多基因绝对定量方法

说明书

本发明提供一种用于PCR阵列的多基因绝对定量方法，待测核酸样品含有至少一种核酸标靶。在测试载具的多个反应孔中分别配置用以扩增多个标准品DNA或欲测定的核酸标靶的引子。之后，将已知拷贝数目的多个标准品DNA及核酸样品混合加入反应孔中，对标准品DNA及核酸样品进行qPCR。分别针对每一标准品DNA设计具有序列特异性的正向引子及反向引子的组合，在正向引子及反向引子所对应的区域之间具有相同的DNA模版序列。用以扩增多个标准品DNA以及欲测定的核酸标靶的引子具有相似的扩增效率。

技术领域

本发明涉及一种绝对定量方法，尤其涉及一种用于PCR阵列的多基因绝对定量方法。

背景技术

随着现代生医技术的发展及临床需求，许多诊断方法需要针对目标基因进行绝对定量。举例而言，HIV或C型肝炎(HCV)等感染的病毒量(viral load)及疗程监控，或是器官移植病人的病毒量监控。在现有技术中，若欲使用qPCR技术以96孔盘进行测定，则须将标准品与待测样品放在不同的孔洞中，以避免彼此干扰，因此，须使用相当多的孔洞数，对实验流程进行以及测试成本上造成不良影响。

基于上述，针对具有多个反应孔的测试载具，在运用qPCR技术对核酸样品进行绝对定量时，如何改善实验顺畅度并降低测试成本，为目前所需研究的重要课题。

发明内容

本发明提供一种用于PCR阵列的多基因绝对定量方法，针对具有多个反应孔的测试载具，在运用qPCR技术对核酸样品进行绝对定量时，能够有效地改善实验顺畅度并降低测试成本。

本发明用于PCR阵列的多基因绝对定量方法，包括以下步骤，待测核酸样品含有至少一种核酸标靶。在测试载具的多个反应孔中分别配置用以扩增多个标准品DNA或欲测定的核酸标靶的引子。之后，将多个已知拷贝数目但数目不同的标准品DNA及待测核酸样品混合加入多个反应孔中，对多个标准品DNA及核酸样品进行qPCR。各标准品DNA分别具有针对每一标准品DNA设计的具序列特异性的正向引子及反向引子的组合，以避免在多个标准品之间产生干扰以及标准品与待测样品之间彼此干扰，因此，多个标准品DNA可在相同反应中混合且独立扩增而不彼此影响。此外，用以扩增多个标准品DNA以及欲测定的核酸标靶的引子具有相似的扩增效率，多个标准品DNA在正向引子及反向引子所对应的区域之间具有相同的DNA模版序列，用以确保扩增多个标准品DNA以及欲测定的核酸标靶时不会有差异，以准确测出待测物的拷贝数目。

在本发明的一实施例中，以拷贝数目对数值[log(拷贝数目)]为横轴，Cq值为纵轴，依据多个标准品DNA的拷贝数目对数值[log(拷贝数目)]以及Cq值制作标准曲线之后，将核酸标靶的Cq值代入标准曲线，以得到核酸标靶的拷贝数目。

在本发明的一实施例中，扩增效率包括Tm值。

在本发明的一实施例中，针对测试载具的多个反应孔分出多个群组(cluster)，每一群组由多个反应孔组成，在每一群组的多个反应孔中配置同一种用以扩增标准品DNA或核酸标靶的引子。

在本发明的一实施例中，每一群组的反应孔组成为3×3。

在本发明的一实施例中，每一群组用以针对多个标准品DNA中的其中一者或单一种类的核酸标靶进行qPCR。