[发明专利]一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人生长激素的方法

权利要求书

1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人生长激素的方法，依次包含以下步骤：

1)从重组人生长激素基因工程水稻种子中提取含有重组人生长激素的粗提取物；

2)将含有重组人生长激素的粗提取物经Bestarose Diamond MMC阳离子交换层析分离纯化，得到初级产物I；

3)将初级产物I经Q Sepharose FF阴离子交换层析分离纯化，得到含有重组人生长激素的中级产物II；

4)将中级产物II经phenyl HP疏水层析分离纯化，得到纯化的重组人生长激素目标物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述重组人生长激素粗提取物是通过下述方法制备：

i)将含有重组人生长激素的基因工程水稻种子粉碎后与提取缓冲液按重量/体积比(kg/L)＝1∶5混合，在4～30℃下提取1～2小时；所述提取缓冲液包含5～25mM Tris，5～25mM NaAC，pH为5.5～7.5；

ii)将步骤i)的提取混合物的pH调节至5.0～5.8，并沉淀1～4小时；

iii)过滤步骤ii)的混合物，收集滤液，获得含有高浓度重组人生长激素的粗提物溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，Bestarose Diamond MMC阳离子交换层析采用4～6倍柱体积的pH为5.4～5.6的50mM Tris、50mM NaAc的缓冲液，以170～240cm/h的线性流速平衡层析柱；以步骤1)获得的粗提取物为层析上样液，上样缓冲液的pH为5.2～5.8，电导为3.5～5mS/cm；所述Bestarose Diamond MMC阳离子层析中洗脱目标物的缓冲液包含50mM Tris、50mM NaAC，pH为6.2～6.4。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Bestarose Diamond MMC阳离子交换层析的上样缓冲液的pH为5.2～5.8，电导为4～5mS/cm，上样量为20～40倍柱体积。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，Q Sepharose FF阴离子层析采用10～15倍柱体积的pH为7.0～7.6的25mM Tris-HCl缓冲液，以120～300cm/h的流速平衡柱子；所述Q Sepharose FF层析中的上样液为步骤

2)中MMC阳离子层析洗脱得到的初级产物I调配而成，调配方法为在所述初级产物I中加入等体积的纯水，并调节pH至7.0～7.6，电导为3～3.4mS/cm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Q Sepharose FF阴离子层析中，洗脱杂蛋白的缓冲液包含5～25mM Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，30～40mM NaCl溶液，pH为7.0～7.5；所述Q Sepharose FF阴离子层析洗脱重组人生长激素的缓冲液包含5～25mMTris-HCl，60mM NaCl溶液，pH为7.0～7.5。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Q Sepharose FF阴离子层析使用的洗脱缓冲液包含：洗脱杂蛋白的缓冲液为25mM Tris-HCl，35mM NaCl缓冲液，pH为7.2～7.4，电导为5.5～6.0mS/cm；以及，

洗脱重组人生长激素的缓冲液为25mM Tris-HCl，60mM NaCl缓冲液，pH为7.2～7.4，电导为8.1～8.6mS/cm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，phenyl Bestarose HP层析采用4～6倍柱体积的pH为7.2～7.4，电导为73～76mS/cm的8～12mM磷酸钠、0.5M硫酸铵的缓冲液以50～180cm/h的流速平衡柱子；上样液为Q Sepharose FF层析洗脱液即中级产物II调配而成，调配方法为在所述Q Sepharose FF层析洗脱液中加入终浓度0.5～1M的硫酸铵，并调节pH至7.2～7.4。