[发明专利]一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人生长激素的方法

说明书

本发明提供一种从基因工程水稻中分离纯化重组人生长激素(OsrhGH)的方法。具体包括以下步骤：1)从重组人生长激素基因工程水稻种子中提取含有重组人生长激素的蛋白粗提取物；2)将含有重组人生长激素的蛋白粗提取物经BestaroseDiamondMMC阳离子交换层析，得到初级产物I；3)将初级产物I经Q Sepharose FF阴离子交换层析，得到含有重组人生长激素的中级产物II；4)将中级产物II经PhenylBestaroseHP疏水层析，得到纯化的重组人生长激素目标物。经本发明的方法纯化后的植物源重组人生长激素纯度大于95％，具有高活性，纯化工艺简单，成本低廉等优点，适应大规模生产和应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从基因工程水稻种子中分离纯化 重组人生长激素的方法。

背景技术

人生长激素(human growth hormone,hGH)是由脑垂体前叶嗜酸细胞释放 的一种单一肽链的蛋白质激素，由191个氨基酸残基构成，是腺垂体中含量最 多的激素(约占总含量的50％)。其主要生理功能是对人体各种组织尤其是蛋白 质的合成具有促进作用，通过刺激骨关节软骨和骨骺软骨生长从而达到增高的 功能。

20世纪50年代开始将人源生长激素(GH)应用于临床，由于其源于尸 检人腺垂体，提取困难且易混有病毒和其他垂体激素等物质，因此未进行大规 模临床推广。之后，人们逐渐开始利用化学合成和基因重组方法生产生长激素， 美国基因工程技术公司的基因重组法在1981年实现工业化。美国基因工程技术 公司生产的重组生长激素(商品名为somatrem)含有192个氨基酸，比天然结 构多了一个氨基酸，用于人体后会导致64％的患者出现生长激素抗体。为有效 解决用药后的抗体产生问题，美国礼来和诺和诺德开发了191个氨基酸的生长 激素，但因天然结构依然不同，抗体产生率较高，且容易带入杂质导致过敏反 应发生。20世纪80年代上市的生长激素由于应用哺乳动物的重组合成技术，抗 体产生率很低，但由于可能引入疯牛病病毒，目前被少数生产厂商使用。20世 纪90年代大肠杆菌分泌基因表达技术进行生产生长激素，氨基酸序列相同， 抗体产生率低，生物活性好，目前为大多数国际领先生产厂商使用。20世纪末 到21世纪初，各厂家相继开始研发长效生长激素。

目前市场重组人生长激素均采用大肠杆菌表达(芽孢杆菌、酵母以及哺乳 动物细胞等表达系统也能产生，但是由于表达水平低、成本高等因素，鲜有公 司采用上述系统进行rhGH的生产)，存在表达量低、工艺复杂等缺点，同时其 在临床应用也存在一定的副作用，如注射部位局部一过性反应(疼痛、发麻、 红肿等)和体液潴留的症状(外周水肿、关节痛或肌痛)，另外长期使用可能在 人体内产生抗体从而影响治疗效果。在经济层面上重组人生长激素长效/水针/粉 针年花费分别被为19.5、4.25、2万元。高昂的治疗费用也限制了重组人生长激 素的推广使用。据估计，我国4～15岁矮小症患者达700万，预计存量适用 人群约400万人，每年新增适用人群40～50万人，而目前存量渗透率不到2％， 增量渗透率不到15％。

CN200480043565公开了一种采用疏水层析技术纯化通过DNA重组技术得 到的人生长激素的方法。现有重组人生长激素的分离提纯技术主要围绕从动物 细胞，大肠杆菌菌体，酵母菌体等提取OsrhGH的方法，例如，CN103724425A 公开了一种新的从大肠杆菌菌体中粗提重组人生长激素提取方法。宋学文等将 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中基因克隆表达的人生长激素(hGH)培养物经 Octyl-SepharoseCL-4B疏水层析，SephadexG-100凝胶过滤层析， DEAE-CelluloseDE52离子交换层析，得到了较纯的hGH。(天津医科大学学报， 1995(2):18-20)。

发明内容

本发明在水稻胚乳细胞生物基因工程技术的基础上，进一步研究从基因水 稻种子中表达、提取、纯化重组人生长激素蛋白。蛋白质纯化的目的是将目标 蛋白质从种子蛋白粗提取液的全部组分中分离出来，同时仍保留目的蛋白的生 物学活性及结构的完整性。蛋白质的分离和纯化需根据蛋白的特性及待分离的 其他物质性质来选择合适的纯化方案。