[发明专利]一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用

权利要求书

1.一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种权利要求1或2所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

A、确定NtERF115基因序列；

根据烟草BY-2细胞转录组分析获得NtERF115基因序列，利用此序列设计基因克隆引物：

正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；

反向引物：5’- ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；

B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtERF115基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50 μL，包括：200 ngcDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10 μL，10 mM dNTP 1 μL，2 U的Phusion^® High-FidelityDNA Polymerase，10 μM的正反向引物各1 μL，补水至50 μL； PCR反应在Mastercycler^®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟，回收和纯化PCR产物；

D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下： 4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR^®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养、质粒提取和PCR检测，对阳性克隆进行测序。

4.根据权利要求3所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于C步骤中所述的特异性引物为：

正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；

反向引物：5’- ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；

根据权利要求3所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于D步骤中所述的培养基为：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸馏水中，高温灭菌（121℃，25min）后使用。

5.一种权利要求1所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115在获得烟碱含量显著提高的转基因植株中的应用。