[发明专利]一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用

说明书

本发明公开了一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用，烟碱合成调控基因NtERF115核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtERF115基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtERF115基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控NtERF115基因的表达，可提高烟草烟叶中烟碱含量。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法与应用。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。烟碱是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95%左右。

ERF (Ethylene Responsive Factor) 转录因子基因是调控烟碱合成重要的调控因子。烟草中调控烟碱合成的NIC2遗传位点已被发现是由至少7个ERF基因组成，如ERF189等。ERF类转录因子基因调控烟碱合成的分子机理也逐渐清晰，可以通过直接结合烟碱合成途径基因启动子中的GCC-box 来激活该基因的表达，进而增强烟碱的合成。我们通过对茉莉素处理后烟草BY-2细胞系的转录组进行分析后获得NtERF115基因，并进行了理论研究和应用实践，发现过表达NtERF115能够显著提高烟草烟叶中烟碱含量，为利用植物基因工程技术提高烟叶中烟碱含量提供了靶标基因。

国际上一些知名烟草公司和研究机构正研究利用生物技术手段提高烟草烟碱含量，以提高烟草品质，降低电子烟等产品的烟碱原料生产成本。目前，我国也深入研究烟碱合成的调控机理，为培育高烟碱低焦油烟草品种提供理论基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115；第二目的在于提供所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、确定NtERF115基因序列；

通过分析茉莉素处理后BY-2细胞的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF115。根据该基因序列设计基因克隆引物：

正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；

反向引物：5’- ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；

B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；