[发明专利]一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括牛支原体P30蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠、带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原和镍螯合的供体磁珠。本发明采用基因工程技术制备了牛支原体P30外膜蛋白，采用PEG1500细胞融合技术制备了牛支原体P30蛋白单克隆抗体，将纯化后的重组P30蛋白作为抗原和制备的单克隆抗体间的相互作用，通过样品中抗体与单克隆抗体竞争性结合重组P30蛋白，建立竞争性牛支原体抗体AlphaLISA的检测方法。该检测方法检测时间短，特异性好，灵敏度高，不需洗涤，操作简便，检测成本低。

技术领域

本发明涉及兽医学、免疫学及生物制品学领域，特别的涉及一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis，Mb)是目前发现最小和最简单的能自主复制的原核可导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎等多种疾病，造成巨大经济损失，严重威胁着我国养牛业健康发展。目前，兽医实验室常用的牛支原体检测方法：生物学检测、分子生物学检测以及免疫学检测。生物学检测主要是通过传统的病原分离鉴定，由于支原体属于兼性厌氧生物、对营养要求极其严格、而且培养周期较长(传代培养需72小时以上才能继代)，分离特别耗时；分子生物学检测主要利用PCR技术，目前国外已根据有限的牛支原体基因序列建立了PCR、荧光PCR，但PCR和荧光PCR方法存在操作复杂、检测时间长、所需设备昂贵等缺点，故难以在基层推广；免疫学检测方法则是目前大批量诊断牛群的牛肺炎支原体，最为常用和适用的实验室诊断方法，但以全菌蛋白建立的ELISA特异性不好，与其它支原体有交叉反应，基于重组蛋白或单克隆抗体建立的ELISA灵敏性和特异性都较高，国外已开发成商品化试剂盒，但价格昂贵，检测成本较高，国内发明专利“牛肺炎支原体的诊断试剂及应用”(专利号ZL20131 0071532.X)制备牛肺炎支原体重组蛋白，并作为包被抗原，建立间接ELISA法检测牛肺炎支原体抗体，该方法检测灵敏度较高，但操作步骤较繁琐、需多次洗涤，容易产生非特异性反应。总之，这些方法虽然有各自的优点但都存在着一定的缺陷，很难在基层生产上推广。因此，发明一种快速、简便、高效的检测方法对于牛肺炎支原体疫病的诊断和治疗具有十分重要的意义。

光激化学发光免疫检测技术(AlphaLISA，amplified luminescent proximityhomogeneous assay linked immunosorbent assay)是一种基于微珠的化学发光的新型均相检测技术，与传统的ELISA技术相比具有更高的敏感性、精确性、均一性、背景低、广泛的动态检测范围，而且无需洗涤及样本需求量极少等特点，非常便于快速筛选和自动化。近年来该技术已在医学及分子生物学领域得到了广泛的应用。但针对牛支原体AlphaLISA检测国内外均未见报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，解决现有牛支原体检测方法存在操作繁琐和特异性差的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒，包括牛支原体P30蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠、带有His标签的牛支原体P30蛋白抗原和镍螯合的供体磁珠；所述受体微珠具有发光功能，所述供体磁珠具有感光功能；所述牛支原体P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述编码所述牛支原体P30蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

应用上述牛支原体抗体光激化学发光免疫检测试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：

1)将山羊抗小鼠IgG偶联的受体微珠和镍螯合的供体磁珠分别用1×AlphaLISA稀释剂将其浓度稀释至100μg/ml；