[发明专利]一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用

权利要求书

1.一种LDLR-Lamp2b融合基因，所述LDLR-Lamp2b融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

所述LDLR-Lamp2b融合基因的结构为：Lamp2b的N端-LDLR胞外段-Lamp2b的C端；所述LDLR胞外段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Lamp2b的N端核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述Lamp2b的C端核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种表达权利要求1所述LDLR-Lamp2b融合基因的表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b，其特征在于，所述LDLR-Lamp2b融合基因在Nhe1和BamH1克隆位点处插入载体pcDNA3.1(-)中。

3.一种权利要求2所述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b的构建方法，包括以下步骤：

1)提取小鼠肌肉组织总RNA，反转录得到cDNA；

2)以步骤1)得到的所述cDNA为模板，扩增Lamp2b的N端和Lamp2b的C端，得Lamp2b5和Lamp2b3序列；

3)将步骤2)得到的所述Lamp2b5利用限制性内切酶Nhe1和Xho1克隆至pcDNA3.1(-)载体得pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体；

4)将步骤2)得到的所述Lamp2b3利用限制性内切酶Xho1和BamH1克隆至步骤3)得到的所述pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体上，得pcDNA3.1(-)-Lamp2b载体；

5)通过限制性内切酶Xho1和BspE将LDLR的序列克隆至步骤4)得到的所述pcDNA3.1(-)-Lamp2b载体上，得表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b。

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤2)所述扩增Lamp2b的N端用引物序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示；所述扩增Lamp2b的C端用引物序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示。

5.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤2)所述扩增的程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s～2min，30个循环。

6.权利要求1所述LDLR-Lamp2b融合基因或利用权利要求2所述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b或利用权利要求3～5任意一项所述构建方法构建得到的表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化药物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物的有效成分包括：所述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b转染外泌体包装细胞后生产得到的外泌体。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述外泌体的制备方法包括：将所述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b转染外泌体包装细胞AML12，转染后经10％血清DMEM培养液培养12h，更换为无血清培养基继续培养，收集外泌体。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述收集为收集在所述无血清培养基上培养48～72h之间的细胞产生的外泌体。