[发明专利]一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用

说明书

本发明提供了一种LDLR‑Lamp2b融合基因、表达载体及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明所述LDLR‑Lamp2b融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明将LDLR胞外段和Lamp2b的全长以独特的方式融合作为一个完整的基因，该基因经表达载体转染外泌体包装细胞后，可以将LDLR呈现在外泌体表面，所述外泌体可以携带LDL进入肝脏等组织的细胞，促进LDL的清除，发挥类似于甚至优于PCSK9抑制剂的效果，可用于动脉粥样硬化的防治。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用。

背景技术

心血管疾病位列当前威胁人类健康的三大疾病，即心血管疾病、肿瘤和传染性疾病之首，而动脉粥样硬化又是心血管疾病的最重要的病理学基础之一，是引起心肌梗塞、脑梗塞以及冠心病等心脑血管疾病死亡的主要原因，与许多疾病的发生发展都有关系。防治动脉粥样硬化是防治心血管疾病的根本性措施。

动脉粥样硬化的预防分两级：一级预防，是饮食清淡、不吸烟、不饮烈酒，情志舒畅等；二级预防则是终生使用阿司匹林抗栓，他汀类调脂。其中，阿司匹林对胃肠道的刺激众所周知，长期使用易致胃黏膜损伤，引起胃溃疡及胃出血，而他汀类药物引发2型糖尿病风险高达46％。同时，常规用药并没有真正针对LDL-c升高和HDL-c降低的原因，而只是简单直接的降低胆固醇的合成。LDLR是清除LDL的重要分子，通过识别LDL促进其进入细胞和利用。内源PCSK9还可以竞争性抑制LDLR，导致LDL清除不及时，是动脉粥样硬化发生发展的重要机制。

如何增强LDLR清除LDL的能力，同时阻断PCSK9对其的抑制，有望改善机体LDL水平，降低动脉粥样硬化发生率，是亟待解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用，该载体转染外泌体包装细胞后，产生的外泌体可以携带血管内的LDL进入细胞，促进其利用，同时进入细胞的外泌体，其LDLR成分还可以抑制PCSK9的表达和分泌，进一步促进LDL的清除。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种LDLR-Lamp2b融合基因，所述LDLR-Lamp2b融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述LDLR-Lamp2b融合基因的结构为：Lamp2b的N端-LDLR胞外段-Lamp2b的C端；所述LDLR胞外段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Lamp2b的N端核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Lamp2b的C端核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种表达上述LDLR-Lamp2b融合基因的表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b，所述LDLR-Lamp2b融合基因在Nhe1和BamH1克隆位点处插入载体pcDNA3.1(-)中。

本发明提供了表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b的构建方法，包括以下步骤：1)提取小鼠肌肉组织总RNA，反转录得到cDNA；

2)以步骤1)得到的所述cDNA为模板，扩增Lamp2b的N端和Lamp2b的C端，得Lamp2b5和Lamp2b3序列；

3)将步骤2)得到的所述Lamp2b5利用限制性内切酶Nhe1和Xho1克隆至pcDNA3.1(-)载体得pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体；

4)将步骤2)得到的所述Lamp2b3利用限制性内切酶Xho1和BamH1克隆至步骤3)得到的所述pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体上，得pcDNA3.1(-)-Lamp2b载体；