[发明专利]一种双靶向转换受体、编码基因、重组表达载体、抗肿瘤NK细胞及其制备方法、应用

说明书

本发明涉及一种双靶向转换受体、编码基因、重组表达载体、抗肿瘤NK细胞及其制备方法、应用，属于肿瘤免疫细胞治疗技术领域。本发明的双靶向转换受体分为两段，由PD1胞外段（1‑170aa），DAP10胞外、跨膜及胞内段（19‑93aa）组成的第一受体和由NKG2D全长段（1‑216aa）组成的第二受体，两者在细胞内可以快速的结合，形成双靶向转换受体，该受体可以增强NK细胞对于胃癌细胞的抗肿瘤免疫效应。使用双靶向转换受体改造的Ha‑DTCR‑NK92与NK92细胞相比，对于胃癌细胞MGC‑803细胞的细胞毒性增加了约3倍，而对于胃癌细胞SGC‑7901细胞的细胞毒性增加了约9倍。

技术领域

本发明涉及一种双靶向转换受体、编码基因、重组表达载体、抗肿瘤NK细胞及其制备方法、应用，属于肿瘤免疫细胞治疗技术领域。

背景技术

近年来，肿瘤免疫细胞治疗因其显著的疗效而在肿瘤治疗中大放异彩，特别是基于嵌合抗原受体改造的T细胞（CAR-T），在血液系统恶性肿瘤的临床治疗中展现出良好的靶向性、杀伤力和持久性，其为肿瘤免疫治疗领域最令人信服的突破，为攻克肿瘤打开了新的希望之门。尽管CAR-T技术研发不断取得进步，但却依然面临着诸多挑战。主要障碍之一为：CAR-T虽然具备强大杀死癌细胞的能力，但其本身所引起的过强免疫应答反应潜在威胁患者生命。并且无论CAR-T或是TCR-T等免疫细胞技术，迄今为止对实体瘤的治疗鲜有奏效，而治疗实体瘤恰是抗肿瘤的真正主战场。因此，如何克服CAR-T技术的弊端以及如何能赋予免疫细胞对实体瘤细胞的精准识别与特异杀伤，成为免疫细胞治疗亟待实现的新突破和新跨越。

NK细胞是机体重要的免疫细胞，约占健康人外周血淋巴细胞总数的10%。NK细胞在实体瘤发生发展的早期免疫反应和免疫监视过程中发挥重要作用，为机体抵抗肿瘤的第一道防线，利用NK细胞进行临床治疗已有较长历史。与T细胞相比，NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势：一是它具有不受HLA限制的非特异性肿瘤细胞杀伤作用，主要是通过表面细胞毒受体，触发穿孔素和颗粒酶的释放，产生细胞毒因子和TNF等细胞因子，而不产生IL-2等细胞因子，避免造成致死性细胞因子风暴；二是NK细胞还可通过CD16与抗体Fc片段结合，诱发ADCC特异性杀伤作用；三是NK细胞的杀伤作用具有连续性，可从一个目标移向另一个目标，杀死多达7-10个肿瘤细胞，而T细胞缺乏这种连续杀伤性；四是因为NK细胞寿命短暂，发挥功效后很快会消失，勿需更多考虑类似CAR-T细胞需要自杀基因来限制其持久副作用，这显然要优于T细胞。由于这些有利因素，NK细胞用于患者治疗时有效并且安全。利用NK92而不是T细胞作为宿主细胞，使CAR-NK相比CAR-T，具有更高的安全性和可控性。

免疫检查点是指一类免疫抑制性分子，通过共抑制或共刺激信号一系列途径来调节免疫细胞活性，防止过度免疫激活和确保自身耐受，从而避免正常组织损伤和破坏。程序性死亡受体（ProgrammedDeath1，PD1）是其中一个主要的抑制分子，它具有一个ITSM结构，在与配体PD-L1结合后能够磷酸化，并招募酪氨酸磷酸酶SHP-2，引发抗原受体复合体的去磷酸化，从而抑制通路下游的激活信号，使免疫细胞活化受阻，发挥对免疫细胞活性的负向调控作用。大量研究证据表明，PD1主要表达于活化的免疫细胞表面，其配体PD-L1在正常组织中表达有限，但在大部分实体瘤细胞和免疫抑制细胞中的表达显著增加，肿瘤利用PD1/PD-L1负调控机制实现对抗肿瘤免疫反应的逃逸。目前多项临床前研究和临床试验均指出，采用PD-L1或PD1阻断抗体来增强癌症患者的抗肿瘤免疫应答可作为一种新型的肿瘤免疫治疗手段，并且能够获得持续性的临床应答。

申请公布号为CN107974433A的中国发明专利申请中公开了一种增强型抗肿瘤NK细胞，其为经双重靶向嵌合受体改造的NK细胞，所述的双重靶向嵌合受体由PD1胞外段、NKG2D全长段，以及共刺激分子41BB胞内段组成；该抗肿瘤NK细胞仅对于肺癌细胞作用明显，并且其细胞毒性较低，仅为亲本NK92的3-4倍，不能满足实体肿瘤的治疗需求。

发明内容