[发明专利]一种玉米细菌性枯萎病菌环介导等温扩增试纸条检测方法

说明书

本发明公开了一种用于玉米细菌性枯萎病菌检测的环介导等温扩增横向流动试纸条及其使用方法。所述检测方法，其特征在于，由玉米细菌性枯萎病菌wtsE基因环介导等温扩增横向流动试纸条引物混合液、环介导等温扩增反应预混液、玉米细菌性枯萎病菌阳性及阴性质控品构成。所述引物组，其特征在于，由玉米细菌性枯萎病菌wtsE基因保守区域设计而成，包括一对内引物（FIP，BIP）、一对外引物（F3，B3）和一对5’端分别标记异硫氰酸荧光素和生物素的环引物（LF，LB）组成。所述使用方法，其特征在于，可通过环介导等温扩增横向流动试纸条检测系统实现玉米细菌性枯萎病菌的现场快速检测。本发明提供了一种用于玉米细菌性枯萎病菌快速检测技术手段，特异性强，灵敏度高。

技术领域

本发明涉及一种用于细菌快速检测的试剂盒及检测方法，尤其涉及一种用于检测玉米细菌性枯萎病菌的环介导等温扩增横向流动试纸条检测方法，属于玉米细菌性枯萎病菌检测领域。

背景技术

玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp. Stewartii，Pss)是一种黄色、不运动、革兰氏阴性的兼性厌氧杆菌。寄主主要是甜玉米，也侵染马齿玉米、粉质玉米、硬粒玉米和爆裂玉米。玉米的各个生长阶段都可能受到玉米细菌性枯萎病菌的侵染，典型的症状是矮缩和枯萎。植株在幼苗期感染此病，生长严重受阻，造成矮化萎缩，典型的症状是叶片出现水渍状、长条形的灰绿色至黄色条斑，随着病害的发展，条斑逐渐枯萎，整个植株迅速凋萎，最终死亡。玉米细菌性枯萎病可通过种子和其它繁殖材料等途径进行远距离传播，其地理分布极广，越南、希腊、美国、巴西、圭亚那等国的作物生产都曾因其导致的植物枯萎病而受到重大损失，该病属于世界性病害。《中华人民共和国进境植物检疫潜在危险性病、虫、杂草名录》规定玉米细菌性枯萎病菌属一类有害生物，是所有进出境苗木必须实施的检疫项目。

检测玉米细菌性枯萎病菌的方法主要有：培养基分离培养鉴定法、免疫学检测方法及包括RAPD-PCR、PCR-LCR、Nested-PCR、实时荧光定量PCR等的多种PCR技术。环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification Method，LAMP）法是2000年由日本Notomi博士发明的一种新的核酸扩增技术。其基本原理在于利用4-6个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下对靶序列进行扩增。目前用来判定LAMP扩增结果的方法主要有四种：(1)以扩增产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀为依据观察白色沉淀；(2)反应体系中加入染料观察扩增结果是否产生相应颜色来判定是否有目的片段扩增；(3)通过恒温扩增微流控芯片实时观察反应结果；(4)运用实时浊度仪及实时荧光仪等监测反应结果。前面两种判定方式会因结果颜色不明显而造成肉眼观察不便捷及误判等缺陷，而后两种则需要购置昂贵的分析仪器，因此需要找到一种廉价并能用肉眼便捷、准确观察结果的检测方法。

横向流动试纸条快速检测技术(Lateral Flow Dipstick，LFD)，是生物素（Biotin）标记的扩增产物（或一侧引物）与异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)标记的特异探针（或另一侧引物）杂交，将该复合物滴加到试纸条上，复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线。不被捕获的复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质控线。现阶段，LAMP-LFD技术已用于多个生物检测领域中，并具有高灵敏度、高特异性、快速、方便、成本低和产物易检等优势。本发明建立了一套检测玉米细菌性枯萎病菌wtsE基因环介导等温扩增横向流动试纸条检测方法，为玉米细菌性枯萎病菌的检测及调查分析提供了一种新的简便、快速的途径。

发明内容