[发明专利]一种壳斗科植物样品DNA提取和纯化方法

权利要求书

1.一种壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取植物样品，在研磨时加入交联聚乙烯基吡咯烷酮和/或维生素C，液氮快速研磨成粉；

(2)加入专用漂洗液，震荡离心后弃上清，重复此步，直至上清无色且和沉淀物有明显的分界线；所述专用漂洗液主要包括如下有效组分：2％～4％PVP，1％～2％L-AscorbicAcid，2％～4％Triton-X 100，4％～5％β-mercatoeyhanol；

(3)加入预热的CTAB提取液，60℃～65℃水浴40～60分钟，每5～10分钟颠倒混匀一次；

(4)室温放置冷却2～3分钟后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡，离心；

(5)取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡，离心；

(6)取上清，加入1/10～1/5体积的3M～4M醋酸钠、双倍以上体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30～50min，4℃离心；

(7)去上清，用预冷的75％～80％酒精洗涤沉淀，无水乙醇加速脱水，管口倒置后，晾干，加入TE缓冲液溶解，即得植物基因组DNA；

(8)取植物基因组DNA，通过硅胶粉吸附方法纯化，即得纯化后的植物总DNA。

2.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述硅胶粉吸附方法纯化的步骤如下：

(1)称取硅胶粉，加入超纯水震荡混匀，静置，离心30s～1min后除去上清液，重复此步骤多次；

(2)在洗过多次的硅胶粉中加入超纯水，配成硅胶悬浊液并混匀，分装至各管；

(3)取1管硅胶悬浊液，加入1ml～2ml超纯水，震荡混匀，离心20s～30s，弃上清；

(4)往硅胶悬浊液中加入5M～6M碘化钾，使溶液中的碘化钾最终浓度为4mol/L，配成硅胶吸附液，震荡混匀，加入DNA，室温置于小型摇床上混匀10～15min，离心3～5min；

(5)弃上清，加入硅胶漂洗缓冲液，震荡混匀，离心3～5min，重复此步骤3次；

(6)沉淀用无水乙醇漂洗，将沉淀晾干，加入TE缓冲液，37℃温育10～15min后离心3～5min，将上清转移至新的离心管中；

(7)在离心管中加入3M～4M乙酸钠，多倍体积的无水乙醇，混匀，置于-20℃静置后，4℃离心；

(8)去上清，得到的沉淀用-20℃预冷的75％～80％酒精清洗3～5次，最后用无水乙醇加速脱水，晾干，加入TE缓冲液进行溶解，即得到纯化后的总DNA。

3.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述专用漂洗液在裂解细胞核之前加入，并反复清洗。

4.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述的CTAB提取液包括如下组分：2％～4％CTAB(m/v)，1.4M～2M NaCl，100mM～120mM Tris-HClpH 8.0，20mM～30mM EDTA pH 8.0，10％～15％(w/v)N-Lauroylsarcosine Sodium salt，1.4％～2％β-mercatoeyhanol，10mg/μl RNase A；

所述的CTAB提取液现配现用；所述的CTAB提取液具体配制方法如下：

配置CTAB母液，所述CTAB母液包括：2％～4％CTAB(m/v)，1.4M～2MNaCl，100mM～120mMTris-HCl pH 8.0，20mM～30mM EDTA pH 8.0，120℃高压灭菌20～30min；

配置裂解液，所述裂解液包括：10％～15％(w/v)N-月桂酰肌氨酸钠盐，100mM～120mMTris-HCl pH 8.0，20mM～30mM EDTA pH 8.0，120℃高压灭菌20～30min；

配置所述CTAB提取液，所述CTAB提取液包括：CTAB母液∶裂解液＝10∶1，1.4％～2％β-mercatoeyhanol，5～8μl 10mg/μl RNase A。