[发明专利]一种壳斗科植物样品DNA提取和纯化方法

说明书

本发明公开了一种用于壳斗科植物鲜样和标本的提取和纯化方法，本发明的提取方法在细胞核裂解之前，加入含有抗坏血酸、Triton‑X 100等的专用漂洗液，不仅能有效去除多糖多酚等杂质，使得到的DNA不再粘稠，还能有效去除色素污染，使所提取的DNA纯度高、产率大，相比核裂解之后再进行除杂的步骤顺序效果更优，适于后期分子实验的应用；本发明纯化方法采用硅胶粉自制硅胶吸附液，可有效纯化并获得高纯度DNA，能满足下游PCR及酶切实验。本发明方法克服了传统CTAB法和试剂盒在壳斗科植物提取中的困难，可用于提取壳斗科新鲜叶片、硅胶干燥样及保存年代较长的干燥植物标本样品的DNA，用于高通量测序。

技术领域

本发明涉及一种植物DNA的提取和纯化方法，尤其涉及一种富含多糖多酚类的壳斗科植物样品特别是新鲜样品、硅胶干燥样品、标本样品中DNA的提取和纯化方法。

背景技术

高通量测序技术大多具有数据量大、通用性广和高分辨率等优势，已广泛运用于种质鉴定(Lai，Li et al.2010)、遗传多样性分析(Xia，Guo et al.2009)、遗传图谱构建(Huang，Feng et al.2009)等，成为林木遗传学和分子育种的重要研究工具和手段。

壳斗科(Fagaceae)植物是北半球温带和亚热带森林的重要组成，共有8属，约1047种(Govaerts and Frodin 1998)。我国有7属，约300多种，自然分布于南北各省区，资源丰富，其树皮和壳斗都富含鞣质，坚果(子叶)含大量淀粉，是重要的木材、坚果、栲胶的资源植物(刘茂松，洪必恭1998)，具有重要的经济价值和生态功能。开展壳斗科植物的遗传多样性分析，对壳斗科植物资源的可持续利用和保护有重要意义。

但是，壳斗科植物富含等次生代谢物质，并且这些多糖、多酚会与核酸形成复合物，严重影响了DNA的提取质量，成为高通量测序方法在这一类群上运用的瓶颈。

目前对植物总DNA主要采用SDS法(Edwards，Johnstone et al.1991)，CTAB法(Murray and Thompson 1980)。但是，这些通用提取方法用于提取多糖多酚类物质含量较多的植物时，往往不能获得高纯度的基因组DNA。所获得的总DNA呈棕褐色，被胶冻状多糖物质所包裹，琼脂糖电泳显示DNA有拖尾现象，加样孔发亮，蛋白、多糖和多酚污染严重，难以开展下游实验分析，用市售试剂盒价格昂贵，且提取的DNA产量不高，性价比差。

此外，植物标本由于保存年代较长，DNA化学性质不稳定，容易通过水解或氧化作用自发降解，因而年份越久远的标本，DNA提取的难度越大。并且标本在制作和储藏过程中受到高温、杀虫除菌剂等物理化学因素的干扰，导致标本所含的DNA大量降解、含量低，提取过程中容易因氧化而产生严重的褐化，色素污染严重，再加上得率低，所需样品比一般材料要多，然而有些标本材料又十分有限珍贵，要从这些宝贵的材料中有效提取高纯度基因组DNA用于二代测序等分子生物学实验显得尤为迫切。

当前从动物标本提取DNA有不少报道，也有不少专利，但从植物标本提取DNA难度较大，尚无成熟的通用方法。

发明内容

本发明提供一种壳斗科植物样品DNA提取和纯化方法，能够解决从壳斗科植物样品提取高质量DNA的两大难题：第一，有效去除壳斗科植物富含的多糖多酚杂质并提取出高质量DNA；第二，有效纯化壳斗科植物DNA，同时，本发明还解决了从植物标本提取DNA的难题。

本发明的技术方案如下：

一种壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，包括以下步骤：

第一、取植物样品，在研磨时加入交联聚乙烯基吡咯烷酮和/或维生素C，液氮快速研磨成粉，使用快速研磨方式能够避免样品在空气中暴露时间过长导致降解；