[发明专利]一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤；

1)3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原的制备：

称取100～200mg 3-甲基喹恶啉-2-羧酸加入干燥的圆底烧瓶中，向其中加入5～7mL四氢呋喃，使其完全溶解，再加入300～400mg EDC和400～500mg NHS，常温磁力搅拌过夜，制备成A液，取100～150mg 4-氨基丁酸，溶解于4～5mL 0.05mol/L，pH 9.6的碳酸钾缓冲溶液，制备成B液；将B液加入到A液中，继续搅拌反应2小时，停止反应后，用三氯甲烷进行萃取，收集有机相；将收集的有机相在35℃下进行旋转减压蒸馏，蒸馏完成得到粉色物质，用1～3mL展开剂，将得到的物质溶解，用毛细管点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0～1.5cm，样品点直径一般不大于2mm，点间距离可视斑点扩散情况决定，将点连成线即可；点样时必须注意勿损伤薄层表面；将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭，待展开至距离另一底边2～3cm即可，取出薄层板，晾干，在暗箱三用紫外线分析仪254nm下观察，将需要的条带刮下来，收集所有薄层板的硅胶沙，将收集的硅胶沙浸泡于乙酸乙酯中，涡旋震荡，离心，取有机相，用0.22μm的有机膜将有机相过滤，重复洗涤3～5遍；收集有机相进行45℃旋转减压蒸发，收集沉淀，进行真空干燥；得到的物质即为3-甲基喹恶啉-2-羧半抗原；

2)3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原与载体蛋白偶联制备免疫原：

5～15mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入10～20mg EDC和10～20mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液；将15～30mgKLH置于25ml圆底烧瓶中，溶解于5～6mL 0.05mol/L，pH 9.6的碳酸钠缓冲溶液中，制成B液；将A液缓慢滴加反应液B中，每1～2分钟滴加5～10uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜；次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液；透析后，得到免疫原1，即Hapten-KLH；称取20～30mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入30～35mg EDC和15～30mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液；将15～30mg OVA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于2～6mL0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲溶液中，制成B液；将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜。次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液；透析后，得到免疫原2即，Hapten-OVA，称取10～30mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解。再加入10～30mg EDC和10～15mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液，将10～30mg BSA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于2～6mL0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲溶液中，制成B液，将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜，次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液。透析后，得到免疫原3即，Hapten-BSA；

3)免疫动物，制得3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体。