[发明专利]一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明提供了一种高特异性3‑甲基喹恶啉‑2‑羧酸(MQCA)多克隆抗体的制备方法，属于免疫分析技术。所述多克隆抗体是由3‑甲基喹恶啉‑2‑羧酸(MQCA)半抗原与载体蛋白结合，免疫动物制成，所述3‑甲基喹恶啉‑2‑羧酸(MQCA)半抗原是采用活化酯法将3‑甲基喹恶啉‑2‑羧酸(MQCA)与4‑氨基丁酸连接制成。本发明制备的3‑甲基喹恶啉‑2‑羧酸(MQCA)多克隆抗体具有较高的特异性，填补了3‑甲基喹恶啉‑2‑羧酸(MQCA)高特异性多克隆抗体制备研究方向的空白。

技术领域

本发明属于小分子化合物免疫分析技术领域，涉及一种喹噁啉类 抗菌药物的高特异性多克隆抗体的制备方法。

背景技术

喹乙醇一种理想的饲料添加剂，是喹噁啉类二氧化物，它是一种 具有促生长作用的药物性添加剂，具有抗菌与蛋白同化作用，兼有促 进生长作用。3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)是包括喹乙醇，乙酰甲 喹，喹烯酮在内的喹恶啉类药物的主要代谢物之一。喹乙醇常在水产 养殖中用作饲料添加剂促生长及用于淡水鱼类出血性败血症的治疗， 一度有“水产瘦肉精”的美誉。然而喹乙醇的过度使用和不当使用容 易造成水产动物急性和慢性蓄积型中毒，如捕捞和运输过程中大批量 死亡，出现腹水和出血症，长期过量添加有致突变，致畸作用。这类 已中毒的鱼或未出现中毒症状但体内蓄积了高剂量喹乙醇的鱼被人食用后，将在人体内蓄积对人有潜在的致畸，致癌，致突变作用，严 重危害人体健康。2001年农业部第168公告和2005年兽药典都明 确规定禁止喹乙醇用于水产养殖中。因此，喹乙醇的残留监控对水产 品质量安全具有重大意义。喹乙醇经消化道吸收后，大部分经肾随尿排出，少部分随粪便以原形体排出体外。因此，喹恶啉类药物很少残 留在组织中，单独检测喹乙醇原药残留情况不能如实反应喹乙醇的残 留情况。喹乙醇能在动物体内迅速代谢成十多种代谢产物，其中主要 代谢产物为MQCA，能在体内稳定存在，引起代谢物在动物组织残 留。1991年，世界粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)将MQCA 作为喹乙醇的残留标示物。因此同时检测喹乙醇原药及其残留标示物 MQCA能准确地反应出喹乙醇的残留情况。另外，MQCA还是喹恶 啉类药物喹烯酮，乙酰甲喹的主要代谢物，对MQCA的残留检测更 能如实地反应出喹恶啉类药物的残留情况。

目前关于喹乙醇及其代谢物的检测方法有很多，对MQCA的残 留的主要检测手段为高效液相色谱法为基础的仪器分析方法以及以 抗体为基础的免疫分析方法。传统仪器方法存在前处理复杂，仪器和 相应配套费用昂贵，无法大规模进行平行样同时检测等缺点。酶联免 疫分析法具有方法简单，方便讯速，特异性强等优点，在MQCA残 留检测中还没有广泛应用，有良好的发展前景。

在酶联免疫分析法中，半抗原及人工抗原的合成通常是制备抗体 的关键步骤，所以本发明的关进技术是半抗原的结构设计。3-甲基喹 恶啉-2-羧酸作为一种小分子物质不具有免疫原性，不能直接免疫动 物产生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗 原，并与大分子载体连接构成接合物，才能免疫动物产生针对性的特 异性抗体。这种半抗原与大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗 原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方式、载体种类、以及半 抗原与目标分析物任何结构上的差异如大小、形状、成份、构型、构 象、极性、电子云密度等等在内的诸因素，都可能极大地影响着相应 抗体的性质，因此人工抗原的制备是决定产生其特异性抗体的关键。

发明内容

本发明旨在通过人工抗原的制备，建立一种高特异性3-甲基喹恶 啉-2-羧酸(MQCA)多克隆抗体的制备方法，为后续的研究夯实基 础，以实现对3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)的定量检测。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)多克隆抗体的制备包括人工抗原 的制备和动物免疫过程，包括如下步骤：

1)3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)半抗原的制备：