[发明专利]一种HANK细胞培养上清液的制备及其在化妆品中的应用

权利要求书

1.一种HANK细胞培养上清液，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

(1)采集自体或异体健康人抗凝外周血，或脐带血；

(2)用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；

(3)把所得单核细胞悬浮在NK细胞无血清培养液中，添加IL-2及膜嵌合细胞因子，37℃及CO₂孵箱中培养10-16天，常温条件下离心分离HANK细胞及其上清液，分别收集HANK细胞及其培养上清液。

2.根据权利要求1所述的HANK细胞培养上清液，其特征在于，所述的无血清培养液是X-Vivo15无血清培养液。

3.根据权利要求1所述的HANK细胞培养上清液，其特征在于，其培养的HANK细胞每升≥4×10¹⁰个。

4.根据权利要求1所述的HANK细胞培养上清液，其特征在于，其培养的CD56+CD3-NK细胞纯度≥80％。

5.根据权利要求1所述的HANK细胞培养上清液，其特征在于，其培养的HANK细胞对K562靶细胞杀伤率≥80％，效靶比例为10:1。

6.根据权利要求1所述的HANK细胞培养上清液，与可接受的辅料在加工制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，可以为水剂和冻干粉剂。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，水剂的制备方法为：

(1)保存：HANK细胞培养上清液在-20℃以下冰箱保存不超过半年；在-80℃冰箱保存一年以上；

(2)澄清：使用前解冻，在4℃4000rpm离心20min，以进一步除去上清液中的颗粒物，以及在保存及冻融过程中形成的絮状物；

(3)除菌：过0.2μm滤膜除菌；

(4)分装：根据不同的用途需求，分装在适当的容器中；

(5)储存：在-20℃以下冰箱保存不超过半年；-80℃冰箱保存一年以上；

(6)使用：解冻后，4℃冰箱保存，在一周内用完，否则作废。

9.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，冻干粉剂的制备方法为：

(1)澄清：HANK细胞培养上清液在4℃4000rpm离心20min，收集上清液；

(2)加入辅料：甘露醇5％-15％；

(3)除菌：过0.2μm滤膜除菌；

(4)分装：分装在玻璃瓶中，作为大包装原料；或分装在西林瓶中，用溶媒溶解后使用；

(5)冻干：于无菌条件下，-20℃预冻至上清液凝固；将凝固的上清液抽真空，升华干燥，除去冰晶；最后加塞加盖，进行密封；

(6)保存：于-20℃保存冻干粉。

10.根据权利要求1～9任一权利要求所述的HANK细胞培养上清液在化妆品中的应用，其特征在于，抑制皮肤黑素颗粒的形成。