[发明专利]一种制备深海弹性蛋白酶Pseudoalterin的方法

说明书

本发明涉及一种制备深海弹性蛋白酶Pseudoalterin的方法，该方法将深海细菌Pseudoalteromonas sp.CF6‑2种子培养液接种于添加甘氨酸母液的发酵培养基中进行发酵培养，得到的发酵液透析、离心、洗脱，得到深海细菌弹性蛋白酶，该方法用甘氨酸替代屠宰厂副产品牛心管，进行细菌菌株CF6‑2胞外弹性蛋白酶的产酶发酵，不仅发酵成本大为降低，并且因其易获得易储存没有其他副产物的特点，节省人力物力和时间，使菌株CF6‑2胞外酶活达到136.37±3.2 U/mL，与牛心管发酵技术相当，具有很好的环境效益和社会效益。

技术领域

本发明涉及一种制备深海弹性蛋白酶Pseudoalterin的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

海洋中含有地球上80%的生物，因此海洋生物资源总量巨大。研究表明海洋微生物因其独特的生活环境，分泌的蛋白酶可能具有特殊性质和潜在用途。目前，国内外对于海洋微生物分泌的弹性蛋白酶研究很少，总体开发利用程度低。细菌Pseudoalteromonassp.CF6-2是从中国南海台湾岛西南面九龙甲烷礁区2441米深的海底沉积物中分离得到。研究表明，该菌株能够分泌一种M23家族弹性蛋白酶，Pseudoalterin。该酶对弹性蛋白和肽聚糖都具有很高的降解活性。

Pseudoalterin作为弹性蛋白酶，在医学、食品学和日用化学上都有着广泛的应用潜力。在医药方面可作为治疗药物：（1）治疗高脂血症；（2）防治动脉粥样硬化；（3）抑制脂肪肝发展；（4）治疗慢性气管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病；（5）外用于消除皮肤焦痂、碎屑，用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等症。在食品工业方面可用于对动物难以处理和食用的韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白质废料进行加工。日用化学工业方面，该酶可用于疗效化妆品的生产。国外近年有报道将弹性蛋白酶加入化妆品，可增进、改善皮肤血液循环，并改善皮肤脂质代谢，增强皮肤、毛发的弹性、柔性，延缓皮肤老化，减少皱纹及色素沉着，还能促进头发生长，防止脱发等。

Pseudoalterin作为肽聚糖水解酶，该酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，具有溶菌作用，可用作天然的食品防腐剂，可广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。另外因该酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理革兰氏阳性细菌可以得到原生质体，因此该酶可用作基因工程、细胞工程中细胞融合操作的工具酶。并且该酶对多种致病性革兰氏阳性细菌，特别是耐甲氧西林的多抗金葡菌具有很高的裂解活性，在治疗细菌感染等医疗方面以及化妆品等方面都具有很好的应用潜力。

基于上述Pseudoalterin的应用价值，研发一种Pseudoalteromonas sp. CF6-2分泌的弹性蛋白酶的简易且低成本制备技术将为该酶的商业开发，工业化生产及食品医学应用奠定基础。

中国专利文献CN103320417A（申请号：CN201310228836.2）公开了一种深海弹性蛋白酶的低成本制备方法，该制备方法采用屠宰厂副产品牛心管代替弹性蛋白，进行细菌菌株CF6-2胞外弹性蛋白酶的产酶发酵，发酵成本降低70%以上，菌株CF6-2胞外酶活达到100.02±9.0 U/mL，与之前的技术相比胞外酶活提高了1倍。然而牛心管虽然是屠宰厂的副产品，但仍可作为食品，例如烧烤行业常将其当做食材。大批量购买新鲜的牛心管需要到特定的地方进行购买，并且该制备方法中使用的是牛心管粉，需要将大量新鲜的牛心管外壁的脂肪去除干净，切成1平方厘米左右大小的块状，经真空冷冻干燥仪干燥48小时以上待块状牛心管完全脱水后用打磨机磨成粉状，过20目筛后得到发酵所用的牛心管粉，并且需要于-20℃保存。牛心管粉的制备过程繁琐，劳动强度大，费时费力，其繁琐高成本的处理方式限制了酶的开发应用。

因此，有必要研发一种简易、低成本、高活性、高产量的深海细菌弹性蛋白酶Pseudoalterin的制备方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，本发明提供一种制备深海弹性蛋白酶Pseudoalterin的方法。